Microscopía: ¿Cómo funciona el contraste de fase?

Para comprender la microscopía de contraste de fase, primero se deben entender los conceptos de “fase” en óptica (y lo que un microscopio de contraste de fase pretende observar).

1. La luz puede considerarse como una onda, con una amplitud y una fase. Matemáticamente, las ondas se pueden expresar en la forma general:
[matemáticas] A \ cos (kx-wt + \ phi) [/ math]
donde A es la amplitud, w es la frecuencia, k es el número de onda, y [math] \ phi [/ math] es la fase del campo. Para la simplicidad matemática, las ondas se expresan a menudo en notación fasorial compleja: [matemáticas] Ae ^ {j (kx + \ phi)} [/ math]

La radiación electromagnética en longitudes de onda visibles oscila demasiado rápido para que nuestros ojos (e incluso las mejores cámaras / sensores que tenemos) puedan ver / medir cualquier cosa excepto un promedio de tiempo, de modo que lo único que detectamos de la ecuación anterior es la intensidad (proporcional a [ matemáticas] A ^ 2 [/ math]).
* Nota: técnicas especiales como la interferometría se pueden utilizar para cuantificar la fase, pero no discutiré esas técnicas en este artículo).

2. Los objetos con un índice de refracción diferente de su entorno retrasan / avanzan la luz que pasa a través de él. Como resultado, una onda plana que pasa por uno de estos “objetos de fase” (ignorando la amplitud por ahora) se distorsionará para reflejar este retraso de fase relativo (es decir, el espesor óptico del objeto se refleja en la fase de la onda óptica que tiene pasó a través del objeto)
3. El “problema de imágenes de fase” ocurre cuando intentas crear una imagen de un objeto de fase. ¿Alguna vez has visto un objeto inmerso en un fluido de índice equivalente? Si no, hay un video realmente bueno aquí:
y una demostración de ejemplo se muestra a continuación.
En la imagen de arriba, el diamante de vidrio nos parece “invisible” (o al menos muy difícil de ver) porque tiene una absorción débil en las frecuencias ópticas y un índice de refracción muy similar al del aceite en el que está inmerso. Más Un ejemplo relevante para los biólogos es el de las células sumergidas en el agua.
Hay toneladas de información observada en la “fase” de estas imágenes, pero no tanto en la amplitud.

4. “Imágenes de contraste de fase” se refiere a una variedad de técnicas utilizadas para transferir de algún modo la información de fase a la información de amplitud. Frits Zernike inventó imágenes de contraste de fase en la década de 1930, y el método de “máscara de fase Zernike” de microscopía de contraste de fase se puede entender fácilmente con un poco de matemática / óptica de Fourier.
(Para el lector interesado: la narración personal de Zernike de “cómo descubrió el contraste de fase” está disponible aquí: Página en Ucsc )

La siguiente figura fue tomada de las notas del curso del Profesor MIT Prof. George Barbastathis para 2.710 (Óptica) e ilustra cómo la microscopía de contraste de fase puede implementarse en un sistema óptico clásico “4f / telephoto” ( Para más información sobre sistemas ópticos 4f, vea el artículo de wiki : Óptica de Fourier ).
* Descargo de responsabilidad: yo trabajo en el laboratorio del Prof. Barbastathis y fue un TA de 2.710 hace varios años .

No te obsesiones demasiado con el texto. Explicaré lo que está sucediendo en el párrafo después de la figura. Las cosas importantes a tener en cuenta en la siguiente figura son las siguientes:

1. El campo óptico una distancia focal frente a una distancia focal detrás de una lente son pares perfectos de transformada de Fourier entre sí. (Óptica de Fourier)
2. Por lo tanto, en un sistema 4f, el campo de entrada es transformado de Fourier, multiplicado por una “máscara de alumno” en el plano de Fourier (“plano de pupila”) y luego transformado de nuevo (una transformada de Fourier inversa pero con ejes de coordenadas volteados) en un campo de salida final en el plano de salida.
3. Un microscopio de contraste de fase Zernike pone una “máscara de pupila” especial en el plano de Fourier del sistema óptico que convierte la información de fase invisible / indetectable en variaciones de amplitud observables en la imagen de salida.

Más específicamente, lo que está pasando es:

1. Una onda plana ilumina el objeto de fase, dando como resultado un campo óptico a la derecha del objeto de la forma: [math] g (x, y) = e ^ {j \ phi} [/ math]
2. Dado que el objeto es un “objeto de fase débil” (su índice de refracción es ligeramente diferente del del medio circundante y / o el objeto es lo suficientemente delgado como para que el retraso de fase relativo de la luz pase por el objeto y la luz pase alrededor del objeto es muy pequeño), el campo de arriba se puede aproximar (a través de la expansión de la serie Taylor de primer orden) como: [math] g (x, y) = 1+ j \ phi [/ math]
3. Una máscara de fase (físicamente realizable como un “pequeño bulto de vidrio”) se coloca en el plano de Fourier / pupila del sistema de imágenes. Esta máscara tiene el efecto de “desplazamiento de fase del término de CC” y el espacio de orden cero las frecuencias del campo inmediatamente a la derecha del objeto se desplazan por [math] \ pi / 2 [/ math]. Por lo tanto, el campo de salida tiene un valor de: [math] j + j \ phi [/ math]
4. En frecuencias visibles, todo lo que podemos medir / observar son promedios de tiempo de campos ópticos, entonces lo que realmente medimos es: [matemáticas] 1 + 2 \ phi [/ math]. Si no se utilizó el contraste de fase, la intensidad de salida medida sería [matemática] \ approx 1 [/ math].

5. La mayoría de los microscopios comerciales de contraste de fase emplean un sistema similar en principio al del microscopio de contraste de fase Zernike, pero con algunas modificaciones. Por ejemplo, se usa iluminación fuera del eje en lugar de iluminación en el eje, y se usan “anillos de fase” en lugar del único golpe de vidrio. Además, a menudo se emplea un filtro gris extra (no es necesario para el contraste de fase, pero mejora la calidad de la imagen de salida).
La idea general es “separar la luz de fondo iluminadora de la luz dispersa de la muestra” (wikipedia). El artículo de wikipedia sobre microscopía de contraste de fases describe el proceso bastante bien:

“La luz de iluminación en forma de anillo (verde) que pasa por el anillo del condensador se enfoca en la muestra … Parte de la luz de iluminación se dispersa por la muestra (amarillo). La luz restante no se ve afectada por la muestra y forma la luz de fondo (roja) …

En un microscopio de contraste de fase, el contraste de la imagen se mejora en dos pasos. La luz de fondo se desplaza en fase -90 ° pasándola a través de un anillo de desplazamiento de fase. Esto elimina la diferencia de fase entre el fondo y la luz dispersa, lo que lleva a una mayor diferencia de intensidad entre el primer plano y el fondo (b). Para aumentar aún más el contraste, el fondo se atenúa con un anillo de filtro gris (c) “.

6. Quiero terminar notando que, en realidad, si solo quiere ver los efectos de fase debido a que la luz pasa a través de un objeto de fase, no necesita ningún instrumento especial. Al iluminar con una fuente espacialmente coherente y capturar una imagen desenfocada del objeto, puede ver “información de fase” sobre el objeto que se manifiesta como entidades con forma de anillo alrededor de los bordes / límites del objeto.

Una serie de técnicas llevan este concepto un paso más allá y realmente cuantifican el retraso de fase introducido por los objetos a través de la aplicación de la Ecuación del Transporte de Intensidad a varias imágenes desenfocadas.

7. Otra cosa que podría interesar a los lectores es la obtención de imágenes por contraste de fase de rayos X. Esto es algo de vanguardia en el que varios laboratorios de todo el mundo están trabajando. La siguiente figura es de este documento: Página sobre la naturaleza e ilustra cuánto más detalle se puede observar usando imágenes de contraste de fase de rayos X (derecha / inferior de los pares de figuras) versus técnicas de imágenes de rayos X convencionales (izquierda / Superior).