Por su pregunta, no estoy seguro de qué partes del diagrama y del documento adjunto está haciendo y qué no entiende todavía, así que lo revisaré en detalle.
Este diagrama pertenece a un documento de 2000, que informa el “diseño y construcción de una red sintética para implementar una función particular ” . ¿Qué es eso y por qué alguien se molestó en hacerlo?
* Elowitz y Leibler (los autores) diseñaron una red oscilante, también conocida como feedback positivo y negativo, o activación y represión transcripcional.
* La regulación genética involucra muchas de estas señales. Es útil para los investigadores comprender (a) cómo se ve el vaivén y (b) prototipar cómo podría suceder.
* Tenga en cuenta la frase “para implementar una función particular”. Así es como sabes que no les importa tanto la función, y mucho más sobre el proceso.
Con esto en mente, consulte el diagrama para el repressilador, donde los autores le muestran cómo funciona su red oscilante. Puede obtener la idea general mirando el texto en el medio: hay tres componentes allí (TetR, LacI, lambda cl) que se reprimen el uno al otro. El – | indica represión.
Más específicamente, ese círculo represasilador es un diagrama de plásmidos . Los plásmidos son piezas circulares de ADN que llevan genes que codifican propiedades específicas. Pasan fácilmente de una bacteria a otra (esa es una de las razones por las que las bacterias evolucionan para resistir los antibióticos). Cuando los genetistas quieren impartir alguna propiedad a las células con las que están trabajando, es muy común construir un plásmido con esa propiedad (que se llama vector) y luego transformar su cultivo bacteriano con él (introducirlo en las células de alguna manera, generalmente mediante interrumpir las membranas celulares para que el plásmido pueda entrar).
Los diagramas de plásmidos indicarán los genes de interés. En este:
* El origen pSC101 es el origen de la replicación. Cuando la célula hace otra copia de este plásmido, ese es el lugar donde comienza. Un origen de replicación es una característica estándar de cualquier plásmido.
* ampR es un gen para la resistencia a la ampicilina. La ampicilina es un antibiótico, por lo que generalmente usamos ampR como gen informador. ¿Recuerdas cuando tuvimos que transformar el plásmido en células bacterianas? Bueno, no todos los plásmidos lo hacen con éxito, por lo que tiene algunas células con plásmido y algunas células sin él. Solo queremos los que tienen el plásmido para nuestro experimento, así que tenemos que deshacernos de los fallos. Hacemos eso al esparcir una solución de células en un plato (una placa de Petri) que contiene alimentos para que las células crezcan más ampicilina. De esa manera, solo las células que tienen el plásmido sobreviven.
* Las siguientes tres secuencias codifican las combinaciones promotor / represor involucradas en la red oscilante. (Las secuencias de los promotores hacen que la transcripción genética sea mucho más eficiente, por lo que la mayoría de las veces las personas usan un “promotor fuerte” frente a un gen que quieren transcribir. Todo eso significa que el promotor funciona realmente bien). el sistema descrito por el texto en el medio del plásmido. Cuando se activa el promotor PLlac01, se transcribe el gen para el represor tet (ver cómo el diagrama muestra lacI reprimiendo tet?); cuando se activa el promotor lambda, se transcribe el represor lac (del diagrama, lamba – | lac); y cuando se activa el promotor tet, se transcribe el represor lambda.
* Las cajas negras entre secuencias son regiones de terminación. Aseguran que la transcripción de una región no se “ejecute” en la transcripción de la próxima región.
De acuerdo, ahora veamos el plásmido reportero. Ya tiene una muy buena idea de lo que un reportero podría hacer de nuestra discusión sobre ampR: probablemente le dirá cuándo todas las funciones que desea están en su celular. También tiene una buena idea de lo que sucede en este plásmido del texto: TetR reprime GFP. La GFP (proteína fluorescente verde) se usa comúnmente como proteína indicadora, porque cuando se codifica con éxito hace que las cosas se vuelvan verdes fluorescentes, y se puede medir la fluorescencia, que está relacionada con el nivel de expresión génica (más GFP codificado = más fluorescencia )
* ColE1 es solo un plásmido bacteriano, por lo que espero que esta secuencia indicada en el diagrama contenga algunos genes genéricos que se encuentran en el plásmido. No es tan importante para este experimento.
* kanR es el gen de resistencia a la kanamicina. El mismo tipo de cosas que ampR. (La mayoría, si no todos, los plásmidos de laboratorio tienen algún tipo de gen de resistencia, porque es conveniente para el trabajo experimental).
* Pltet01 / gfp-aav: lo adivinaste, el promotor tet frente al gen que codifica GFP. Tenga en cuenta que si la molécula que reprime el promotor tet está presente, no verá ninguna GFP expresada.
Ahora, ¿cómo funcionan estas cosas juntas en el experimento?
Así es como lo configuraron: “Un cultivo de E. coli MC4100 que contiene
los dos plásmidos y crecidos en medios que contienen IPTG … “
Entonces te dicen que transformaron los plásmidos en algunas células de E. coli.
¿Cuál es la función de IPTG? “Porque el inductor IPTG interfiere con la represión de LacI …”
LacI es una proteína represora que normalmente se unirá a su promotor y evitará la transcripción. IPTG se une a LacI y permite la transcripción.
* En presencia de IPTG, el represor tet se transcribe, por lo que el represor lambda no se transcribe. El represor de Tet evita la transcripción de GFP en el plásmido informador. Resultado: inmediatamente no hay GFP, pero ahora la célula está transcribiendo el represor lacI, por lo que el sistema está a punto de oscilar una vez que se queda sin IPTG del medio y alcanza una masa crítica de LacI.
* LacI reprime el represor tet. GFP se transcribe y se expresa. El promotor tet está activo, por lo que se expresa el represor lambda. Esto evita la transcripción de lacI.
* Vuelva a infundir IPTG para inducir ciclos adicionales (consulte la Fig. 2).
¿Por qué fue eso interesante?
“Recientes trabajos teóricos han demostrado que los efectos estocásticos pueden ser responsables
para operaciones ruidosas en redes naturales de expresión génica […] En general, quisiéramos distinguir tales efectos estocásticos de posibles dinámicas intrínsecamente complejas (como la intermitencia o el comportamiento caótico). Se necesitan más estudios para identificar y caracterizar las fuentes de fluctuaciones en el represasilador y otras redes diseñadas “.
Este experimento de una década ayudó a caracterizar el grado de ruido que es normal incluso en una red estrechamente controlada que utiliza solo componentes bien conocidos. Las redes de expresión genética natural tienen mucho que hacer a la vez, y todavía estamos tratando de entender cómo encajan todas las piezas.
¡Espero que esto ayude!
Citación:
Elowitz M y Leibler S, 2000, una red oscilatoria sintética de reguladores transcripcionales, Nature 403 (6767): 335-8.