Me gustaría ir con los métodos utilizados para hacer la colección KEIO.
Aquí hay un buen papel para comenzar (es gratis): http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubm…
El protocolo exacto para la eliminación de un solo paso se puede encontrar a través de: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubm…
Este protocolo OWW tiene instrucciones muy buenas: http://openwetware.org/wiki/Reco…
Debería necesitar, además de las cosas habituales de biología molecular:
- Sulfato de kanamicina
- La kanamicina resiste el gen (plásmido pKD3 o pKD4)
- Recombinasa FLP
Para la validación, simplemente me gustaría secuenciar el gen de interés. La manera más fácil sería extraer por PCR el gen de interés y verificar si el gen ya no está allí.
Si realmente quieres ser barato, puedes pedirle al Coli Genetic Stock Centre una reserva de células de la cepa original: http://cgsc2.biology.yale.edu/in…
