La fluorescencia activa la clasificación de células ordena las células en función de la presencia de una proteína fluorescente específica. Como le permite seleccionar solo las células que expresan una determinada proteína, es una tecnología esencial para muchas aplicaciones que van desde la evolución artificial de mejores anticuerpos [1] [2] hasta la determinación de los recuentos de células T CD4 + después de la infección por VIH. [3]
La clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) funciona impartiendo una carga a las células basándose en la presencia de una etiqueta de fluorescencia que, en presencia de un campo eléctrico, desvía el flujo del medio celular para separar los matraces de las células marcadas y no marcadas.
Cómo funciona: [4]
- Las celdas están hechas para pasar un solo archivo a través de un canal a un detector con un espacio relativamente grande entre las celdas. Esta es una parte crítica del proceso; la precisión sufrirá mucho si hay más de una celda a la vez y el flujo debe ser lo suficientemente lento para garantizar una conmutación precisa. En teoría, esto podría lograrse utilizando un canal muy estrecho, pero en la práctica se usa el enfoque hidrodinámico debido a la dificultad de crear canales muy estrechos y evitar la obstrucción. [5] La muestra se inyecta en una corriente externa del fluido de funda a una presión más alta y, por lo tanto, a un flujo más rápido. Si esto se hace bien, el arrastre hidrodinámico del fluido de funda crea un chorro estrecho no mezclador de la muestra, cuyo ancho se puede ajustar cambiando el caudal del fluido de funda.
- La corriente se fuerza a través de una boquilla que vibra a frecuencias de ultrasonido. Esto rompe la corriente continua en una serie de gotas discretas (izquierda, de [4]). Al mismo tiempo, las gotas * reciben una carga eléctrica.
- En el foco, cada gotita ** se ilumina con un láser de la longitud de onda apropiada para el fluoróforo. Se usan dos detectores. Uno se coloca en ángulo recto para recoger la luz fluorescente. El otro está en la trayectoria del rayo láser para medir la luz dispersa hacia delante. El detector de fluorescencia detecta solo las células con su objetivo, el detector de luz dispersa detecta la presencia de cualquier célula. De [4] :
- Una señal retardada de los detectores en el paso 3 activa una de dos placas con potencial eléctrico opuesto. Una señal de fluorescencia activa una placa y la desvía hacia la derecha (figura 1, izquierda). Una señal de dispersión sin una señal de fluorescencia activa la otra placa y desvía la corriente hacia la izquierda. No hay señal de ningún tipo (no hay celdas presentes) no produce deflexión.
Puntos técnicos
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* Técnicamente, la corriente de muestra recibe una carga eléctrica antes de convertirse en gotas.
** En realidad, sigue siendo la corriente en este punto. La nebulización a las gotas ocurre después del enfoque del láser (vea la primera figura). Se hace de esta manera porque cargar una corriente en contacto con el anillo eléctrico es más fácil y más confiable que cargar una gota. [6] La transmisión se cobra por exactamente un período de gota.
Notas a pie de página
[1] Aplicaciones de la clasificación de células en biotecnología
[2] Técnicas de laboratorio en biología: ¿Cuáles son las aplicaciones más comunes de la evolución dirigida?
[3] Aplicaciones traslacionales de la citometría de flujo en la práctica clínica
[4] Clasificación celular activada por fluorescencia
[5] http: // enfoque hidrodinámico – un …
[6] Cómo se cargan las gotas y se determinan los retrasos de caída durante un experimento de clasificación de células electrostáticas | Citometría Experta
