¿Qué es la tinción de gram de bacterias? La mancha está preparada por qué material?

La tinción de Gram es una técnica de laboratorio bacteriológico

utilizado para diferenciar especies bacterianas en dos grupos grandes (gram positivos y gram negativos) en función de las propiedades físicas de su pared celular.

La tinción de Gram no se usa para clasificar las arqueas anteriormente arqueobacterias, ya que estos microorganismos producen respuestas muy variables que no siguen sus propiedades filogenéticas.

Todas las manchas no tienen los mismos contenidos. la mancha más general utilizada en el laboratorio es GEIMSA STAIN.

Para hacer 500 ml de tinción de Giemsa, el material requerido es:

• Giemsa en polvo o tintura, 3.8 g (preferiblemente grado de Comisión de tinción biológica, para garantizar un producto muy bueno de calidad estándar; metanol absoluto, puro, de alto grado, libre de acetona, 250 ml; • glicerol, grado alto, puro, 250 ml;

• cuentas de vidrio sólido limpiadas con metanol, 3-5 mm de diámetro, 50-100 piezas; • una espátula o cuchara medidora; • pesar el papel; • un cilindro graduado; • un embudo de vidrio o plástico; • una botella de vidrio oscura o ámbar con tapa de rosca, limpia y seca, con capacidad de 500 ml (si no está disponible, se puede usar una botella de vidrio o polietileno limpia y químicamente limpia, seca y de tamaño adecuado, pero debe estar envuelta en papel oscuro papel); • una balanza analítica capaz de pesar hasta 0.01 g; y • un agitador, si está disponible.

PRECAUCIONES DE SEGURIDAD •

Las manchas de metanol y Giemsa son inflamables y muy tóxicas si se inhalan o se ingieren. Evite el contacto y la inhalación. Cuando no estén en uso, deben almacenarse en un armario o gabinete cerrado. • Deben tomarse precauciones universales, incluido el uso de equipo de protección personal relevante, como guantes, gafas de seguridad y un abrigo o bata de laboratorio. Ver MM-SOP-11: Procedimientos generales de seguridad en el laboratorio de microscopía de la malaria

La tinción de Gram no es una herramienta infalible para el diagnóstico, la identificación o la filogenia, y su uso es extremadamente limitado en microbiología ambiental. Se usa principalmente para hacer una identificación morfológica preliminar o para establecer que hay un número significativo de bacterias en una muestra clínica. No puede identificar bacterias a nivel de especie, y para la mayoría de las condiciones médicas, no debe usarse como el único método de identificación bacteriana. En los laboratorios clínicos de microbiología, se usa en combinación con otras técnicas tradicionales y moleculares para identificar bacterias. Algunos organismos son grampositivos (lo que significa que pueden teñir negativos o positivos); algunos no están teñidos con tinte usado en la técnica de Gram y no se ven. En un moderno laboratorio de microbiología ambiental o molecular, la mayoría de las identificaciones se realizan utilizando secuencias genéticas y otras técnicas moleculares, que son mucho más específicas e informativas que las tinciones diferenciales.

Se ha sugerido que la tinción de Gram es una herramienta de diagnóstico tan eficaz como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en un informe de investigación primario sobre la uretritis gonocócica.

Médico

Las manchas de Gram se realizan en una biopsia cuando se sospecha una infección. Las tinciones de Gram producen resultados mucho más rápido que el cultivo y son especialmente importantes cuando la infección puede marcar una diferencia importante en el tratamiento y el pronóstico del paciente; ejemplos son el líquido cefalorraquídeo para la meningitis y el líquido sinovial para la artritis séptica.

Mecanismo de tinción

Las bacterias Gram-positivas tienen una pared celular similar a una malla gruesa hecha de peptidoglicano (50-90% de la envoltura celular) y, como resultado, están teñidas de color púrpura por violeta cristal, mientras que las bacterias Gram negativas tienen una capa más delgada (10% de células sobre), por lo que no retiene la mancha púrpura y está contrateñida de rosa por safranina. Hay cuatro pasos básicos de la tinción de Gram:

• Aplicando una mancha primaria (voilet de cristal) a un frotis fijado al calor de un cultivo bacteriano. La fijación del calor mata algunas bacterias, pero se usa principalmente para fijar las bacterias al portaobjetos para que no se enjuaguen durante el procedimiento de tinción
• La adición de yoduro, que se une a cristal violeta y lo atrapa en la célula
• Decoloración rápida con etanol o acetona.
• La contratinción con safranina a veces se sustituye por safranina, ya que tiñe las bacterias anaeróbicas con mayor intensidad, pero se usa con menos frecuencia como una contratinción

Crystal voilet (CV) se disocia en soluciones acuosas en CV +
y iones cloruro (Cl-). Estos iones penetran a través de la pared celular y la membrana celular de las células gram-positivas y gram-negativas. El CV +
el ion interactúa con los componentes con carga negativa de las células bacterianas y tiñe las células de púrpura.

El yoduro interactúa con CV + y forma grandes complejos de cristal violeta y yodo (CV-I) dentro de las capas internas y externas de la célula. El yodo a menudo se conoce como mordiente, pero es un agente de captura que impide la eliminación del complejo CV-I y, por lo tanto, da color a la célula.

Cuando se agrega un decolorante como alcohol o acetona, interactúa con los lípidos de la membrana celular.

Una célula gramnegativa pierde su membrana externa de lipopolisacárido y la capa interna de peptidoglicano queda expuesta. Los complejos CV-I se lavan de la célula gramnegativa junto con la membrana externa

Por el contrario, una célula grampositiva se deshidrata a partir de un tratamiento con etanol. Los grandes complejos CV-I quedan atrapados dentro de la célula gram-positiva debido a la naturaleza multicapa de su peptidoglicano.

El paso de descoloración es crítico y se debe sincronizar correctamente; la tinción de cristal violeta se elimina de las células tanto positivas como negativas si el agente decolorante se deja demasiado tiempo (en cuestión de segundos)

Después de la decoloración, la célula grampositiva permanece morada y la célula gramnegativa pierde su color púrpura

La contratinción, que generalmente es safranina cargada positivamente o fucsina básica, se aplica por última vez para dar a las bacterias gramnegativas decoloradas un color rosado o rojo.