Lector de advertencias: todavía no he clonado y purificado una enzima silvestre con mis propias manos, por lo que podría haber errores o descripciones atípicas. Además, hago un uso intensivo de la jerga, pero (con suerte) cada vez que presento un nuevo término, proporciono un enlace a Wikipedia.
Digamos que tienes un microbio que sabes que cataliza la conversión de una sustancia química (también conocida como sustrato) en otra sustancia química (también conocida como el producto) y quieres aislar la enzima que cataliza esta reacción. En primer lugar, necesita un ensayo que le diga si una muestra contiene la actividad enzimática deseada. En la mayoría de los casos, su ensayo consistirá en agregar alguna sustancia particular a su muestra y detectar su transformación en el producto deseado. (Por supuesto, si el microbio produce naturalmente el sustrato para la enzima que está tratando de aislar, todo lo que tiene que hacer es detectar el producto en su muestra). Los esquemas más generales para detectar su producto se basan en la cromatografía y / o espectrometría de masas, pero estas tecnologías solo pueden procesar 10 ^ 2-10 ^ 3 muestras / día. Alternativamente, a menudo puede identificar alguna sustancia conocida (o diseñar una nueva) que cambia de color o fluorescencia cuando ha sido transformada por su actividad enzimática de interés, lo que le permite detectar la actividad mediante un cambio de color o fluorescencia (p. Ej. X- gal es una sustancia química que cambia de blanco a azul cuando es escindida por la enzima Beta-galactosidasa). Los ensayos de fluorescencia y colorimétricos se pueden aplicar a más de 10 ^ 5-10 ^ 6 muestras / día con la ayuda de un robot de manejo de líquidos, o incluso 10 ^ 8-10 ^ 9 muestras / día usando ciertas tecnologías microfluídicas o citometría de flujo. Finalmente, con un poco de astucia podrías construir un sistema en el que el crecimiento de un organismo de laboratorio dependa de la actividad de tu enzima (por ejemplo, E. coli de laboratorio que muere naturalmente con el antibiótico cloranfenicol solo crecerá en medio que contenga cloranfenicol si está produciendo una enzima extraña como la cloranfenicol acetiltransferasa que desintoxica el antibiótico una vez que ingresa a la célula.) Esta situación se denomina “selección” para el crecimiento bajo alguna condición.
Si puedes cultivar tu microbio que contiene actividad, entonces un buen lugar para comenzar sería cultivar una gran cantidad, secuenciar su transcriptoma (¡la secuenciación es relativamente barata hoy en día!) Y buscar transcripciones que parezcan codificar tu enzima de interés usando herramientas bioinformáticas (BLAST contra secuencias de enzimas que usted conoce tienen una función similar, búsqueda de dominios Pfam, etc.) Si esto produce alguna derivación, entonces un siguiente paso sería intentar amplificar por PCR los genes correspondientes a esas transcripciones fuera del ADN genómico de su organismo o de una biblioteca de ADNc elaborada a partir de su transcriptoma (o sintetizar los genes), y clonar esos genes en un vector de expresión que utilizará para transformar una cepa de laboratorio (generalmente E. coli ) para producir su enzima. Si todo va bien, el lisado bruto de uno de sus clones mostrará actividad en su ensayo, confirmando que corresponde a la enzima de interés.
Por otro lado, si no tiene buenas suposiciones sobre qué gen codifica su enzima pero tiene un ensayo que puede procesar decenas de miles de muestras, puede tomar toda su biblioteca de ADNc y clonarla en un vector de expresión de modo que tiene una biblioteca de plásmidos que contienen cada uno un gen codificador de proteínas de su organismo de interés, del cual tratará de extraer el gen que codifica su enzima. Transformas tu cepa de laboratorio con esta biblioteca (un plásmido / célula) y creces las células transformadas en un plato grande. Cada colonia contendrá células idénticas (también conocidas como “clonales”) que portan uno de sus plásmidos de biblioteca (y, por lo tanto, un ADNc de su organismo de interés). Si tiene la suerte de tener una selección como su ensayo, las únicas colonias que encontrará en este punto son aquellas que expresan su enzima de interés. Sin embargo, si su ensayo es una pantalla, debe elegir colonias (¡o hacer que un robot de selección de colonias lo haga!) Cultive cultivos en placas de microvaloración o gotitas y analice esos cultivos para detectar actividad.
Desafortunadamente, en algunos casos, el gen o cDNA que codifica su enzima de interés no “funcionará correctamente” en su cepa de laboratorio, por lo que terminará sin hits de su pantalla o selección. En este punto, para proceder debes cultivar una gran cantidad de tu organismo de interés, lisar las células e intentar purificar tu enzima de interés de la mezcla de miles de otras proteínas expresadas por el organismo. Típicamente, fraccionará el lisado usando uno o varios métodos de cromatografía de proteínas e identificará qué fracción contiene su actividad enzimática de interés usando su ensayo. Probablemente tendrá que fraccionar recursivamente varias veces esa fracción “activa” usando diferentes separaciones hasta que pueda encontrar una secuencia de separaciones que proporcione una fracción que contenga solo una proteína (según lo determine la electroforesis en gel de poliacrilamida) y que muestre actividad enzimática de interés; ahora has aislado tu proteína desconocida. Para determinar su secuencia de aminoácidos, puede usar una secuenciación de proteínas como la degradación de Edman (old school) o la digestión en péptidos cortos seguidos de espectrometría de masas (esto requiere emparejar los péptidos identificados con las proteínas predichas del transcriptoma secuenciado de su organismo). enzimas (incluso parciales) secuencia de aminoácidos puede buscar su correspondiente ADNc en su biblioteca, y una vez que lo haya encontrado, puede PCR de su biblioteca o resintetizar el gen para mejorar su compatibilidad con la expresión en E. coli.
En el escenario más desafiante, no puedes cultivar tu cultura con tu organismo putativo que contiene actividad. La única manera de proceder en este caso (hasta donde yo sé) sería secuenciar el metatranscriptoma de la comunidad de microbios donde se encontró el suyo, y proceder como se describe arriba. Cualquier forma en que pueda enriquecer su muestra para su organismo que contiene actividad provocará que sus ADNc se representen de manera más prominente en los datos de secuencia, por lo que es más probable que las lecturas de su secuencia cubran su gen de interés.
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Una vez que finalmente ha aislado el gen que codifica su enzima de interés, lo clona en un vector de expresión y transforma una cepa de laboratorio para expresar su enzima. Luego puede crecer un gran lote de estas células y purificar la enzima para usar en sus aplicaciones.
