¿Qué causa los crecimientos blancos además del crecimiento tisular en el cultivo de tejidos?

Cualquier cosa “sospechosa” observada durante el cultivo celular se aclara al observar bajo el microscopio. Entonces mi primera pregunta es: ‘¿Has observado el’ crecimiento blanco ‘bajo el microscopio?’

Si es así, ¿cómo se ve?

Estoy haciendo esta pregunta porque mencionó que sus células están creciendo bien, lo que probablemente significa que las ha estado observando bajo el microscopio. Si no es así, entonces es incorrecto suponer que las células están creciendo bien simplemente mirando la placa / medio del pozo a simple vista.

Hay varias posibilidades para lo que observará:

  1. Contaminación: también se pueden observar bacterias o levaduras o cualquier otra contaminación sin un microscopio. Un medio contaminado está turbio y huele a funky a diferencia de los medios normales, que es claro e inodoro. Cuando se observa bajo el microscopio, aparte de las células, verá puntos negros flotando en los medios que podrían ser esporas o bacterias. Si esos “puntos” son células bacterianas, también es posible que los vean menear cuando se observan con mayor aumento. Si la contaminación proviene de micoplasma, es posible que no los observe claramente. En ese caso, eche un buen vistazo a sus células con mayor aumento (40X) y observe las células para detectar “vacuolas”. Si las células contienen muchas vacuolas o están llenas de puntos, existe la posibilidad de contaminación por micoplasmas y sus células están muriendo (aunque en su caso, el crecimiento blanco es menos indicativo de micoplasma).
  2. Monocapa superconfluente : como señaló correctamente David Belair, hay una gran probabilidad de que tengas una monocapa over-confluent de células HeLa que las que han formado una lámina celular debido a un espacio de crecimiento insuficiente.

(Fuente: Fabricación de Capas Moleculares Termoreceptoras de Oligopéptidos Elastínicos Autoensamblables que Contienen un Dominio de Unión Celular para la Ingeniería de Tejidos)

Comentarios / sugerencias : no estoy seguro de si este es un requisito del experimento que está realizando, pero evito una combinación de monocapas de células celulares para seguir creciendo las células en la fase exponencial. La expresión de genes y proteínas de las células de una monocapa confluente es significativamente diferente de las de la fase exponencial.

Además, el color de los medios en su placa de pozo se ve rosado.

(Fuente: rojo fenol – Wikipedia)

Esto indica que el pH de su medio está cerca de 8.0. Nuevamente, a menos que este sea el requisito de su experimento específico, las células deben crecer en un medio cercano a pH 7.4. Cualquier pH superior o inferior no es bueno para el crecimiento adecuado de sus células.

Espero que esto haya ayudado.

¿Está flotando la materia blanca encima del medio de cultivo? ¿O está en el fondo de los pozos? ¿Has estado cultivando las células en el mismo plato durante varias semanas, o has estado pasándolas y replatándolas a lo largo de varias semanas?

Creo que debería considerar la posibilidad de que las células en cultivo estén secretando matriz extracelular, especialmente dado que sus cultivos tienen varias semanas de vida. Las células estromales en cultivo secretan una abundancia de proteínas ECM que se depositan en su superficie apical y basal, y si los cultivos se mantienen durante demasiado tiempo en la confluencia, la matriz puede desprenderse de las células y flotar en el cultivo. Las células HeLa son de origen epitelial pero se ha demostrado que se someten a la biosíntesis de colágeno en cultivo [1], y la literatura describe su capacidad para expresar colágeno IV y colágeno V [2]. Un estudio reciente cuantificó el secretoma de las células HeLa y encontró muchas proteínas de la matriz extracelular que se produjeron dentro de las 24 horas del cultivo (colágenos 1A1, 2A1, 3A1, 4A1, 4A2, 5A1, 7A1, 8A1 11A1, 11A2, 12A1, fibronectina, lamininas A4 , A5, B1, C1, fibrilinas 1 y 2). [3] Me aventuraría a adivinar que si tu cultura se dejaba durante suficiente tiempo, estas proteínas se acumulaban en tu cultivo y formaban una red densa de proteínas ECM ensambladas que se separaban de las células en láminas después de un cambio medio (que probablemente se rompiera) la superficie de las celdas).

O eso o tienes una formación de biofilm funky pasando.

¡La mejor de las suertes!

Notas a pie de página

[1] http://europepmc.org/backend/ptp

[2] Los genes para los tipos de colágeno I, IV y V se transcriben en células Hela, pero un bloqueo posterior a la inoculación impide la acumulación de ARNm de tipo I

[3] Cuantificación proteómica en profundidad de secretoma celular en medio condicionado que contiene suero

Mi apuesta sería sobre la contaminación del cultivo celular. En base a mi experiencia de cultivo celular y mi experiencia con las células HeLa, las células HeLa son fuertemente adherentes y no flotan ni se desprenden de la superficie de la placa, incluso si las células son confluentes. Además, mencionó que ha estado cultivando las células durante unas pocas semanas, pero los medios permanecen rosáceos, lo cual no es una buena señal. El color de inicio de su medio debe ser rojo, rojo translúcido brillante y, gradualmente, a naranja y luego amarillento. Esto se debe a que el pH de los medios disminuyó debido a la excreción de desechos metabólicos. Un medio rosa es comúnmente el primer signo de contaminación bacteriana ya que el pH del medio de cultivo está por encima de 7 debido a la actividad metabólica de la bacteria. También mencionaste que has estado cultivando las células durante semanas. Dentro de estas pocas semanas, ¿no has pasado / subculturado / dividido las células? Esto es un poco extraño ya que la velocidad de duplicación de la población de las células HeLa es muy corta. Si de hecho no los subcultivó. Incluso si las células están vivas, se ven severamente superadas por la presencia de otro organismo dentro de los medios de cultivo. De lo contrario, deberías subcultivar las células HeLa alrededor de 2 a 3 veces en 7 días. El segundo es que la cosa flotante blanca no debe ser causada por las células HeLa y, por lo tanto, otro sospechoso es la contaminación de las esporas.

Revise su incubadora en busca de signos de contaminación o esporas / moho en las placas. Además, revise sus otras placas de cultivo celular. Y al comienzo del día, cuando abra por primera vez su incubadora, tome una respiración profunda del aire de la incubadora de cultivo celular (puede sonar grave pero es otro parámetro). Si el aire no huele bien, huele mal o como un ligero olor a queso, es probable que haya un poco de contaminación / fermentación y debes preocuparte y hacer una limpieza masiva.

Estoy de acuerdo con Tanmay en que debes echarle un vistazo bajo el microscopio.

¿Algunas semanas, en ese pequeño plato? HeLa crece como una hierba: sin subcultivo, esas células probablemente se amontonen una encima de la otra como locas. Las células densas se ven blancas, como el sedimento celular después de la centrifugación. No tengo experiencia personal con HeLa, pero como células cancerosas, es probable que carezcan de inhibición de contacto y no estén limitadas a una sola capa de células.

… ¿que estás tratando de hacer?

Creo que la causa más probable son las células muertas. Las células HeLa no son realmente inmortales como tal. Pueden ser asesinados por negligencia y también demuestran apoptosis.

Microfotografía electrónica de barrido de una célula HeLa apoptótica. Zeiss Merlin HR-SEM.