Las bacterias Gram-positivas tienen una pared celular bacteriana con una capa gruesa de peptidoglicano fuera de su membrana celular. Esto permite que la violeta cristalina se absorba, lo que es responsable de su mancha de Gram púrpura. Crystal violeta necesita tener yodo añadido para mantenerlo atrapado dentro de la capa de peptidoglicano.
Las bacterias Gram-negativas tienen una delgada pared celular hecha de peptidoglicano, intercalada entre la membrana celular y una membrana externa bacteriana (protección adicional hecha de proteínas y lipopolisacáridos, que confiere resistencia a algunos tipos de sustancias antimicrobianas como la lisozima). Esto significa que Crystal violet no se absorbe. La violeta cristalina se lava fácilmente con etanol incluso a pesar de la adición de yodo, sin embargo, una contratinción como Safranin empapará todas estas capas en la célula para teñir la región nucleoide, por lo que su Gram la mancha es rosada
Nota: si se tiñen bacterias Gram positivas solo con Safranin, también se verán rosas porque su región de nucleótidos está teñida por Safranin, por eso se usa la violeta Crystal, porque solo mancha las bacterias Gram positivas.