¿Cuáles son los límites del análisis de citometría de flujo de la viabilidad celular usando tinción con yoduro de propidio?

Muchos colorantes pueden evaluar la viabilidad celular al usar citometría de flujo – Wikipedia. Los colorantes clásicos como el yoduro de propidio – Wikipedia (PI) y 7 – Aminoactinomicina D – Wikipedia (7AAD) son

• Permeable a las membranas celulares , intercalado con ácidos nucleicos bicatenarios, ADN en particular, de células cuyas membranas se han vuelto más permeables, una señal de que tales células están dañadas o muertas en los tipos de angustia de la membrana celular.
• Barato.
• Se agregó al final del protocolo de tinción, requiriendo poco tiempo o pasos adicionales.

Un tinte económico, cargado positivamente que no puede cruzar una membrana plasmática intacta, PI tiene espectros de excitación y emisión bastante discretos, excita a 488 nm (535 nm máximo) y emite dentro del rango de 570 a 630 nm (emisión de fluorescencia roja).

Descripción completa : por las razones que se explican a continuación, preferí 7AAD a PI para la evaluación de la viabilidad de las células de citometría de flujo y me alejé de ambos a los tintes de amina tan pronto como llegaron a la escena.

Desventajas de PI

• El espectro de emisión de PI se superpone un poco con el de FITC (isotiocianato de fluoresceína – Wikipedia) y mucho con el de PE (ficoeritrina – Wikipedia). La compensación de la superposición espectral de PI con FITC y PE es mucho más desafiante (1) en comparación con 7AAD. Habiendo sido conjugados con éxito a miles y miles de anticuerpos, estos son dos de los caballos de batalla más versátiles y probados en citometría de flujo. La superposición de PI con FITC y PE limita así severamente el alcance de un panel de anticuerpos de citometría de flujo de tinción múltiple.
• Es necesario utilizar el control de compensación de células muertas para PI y 7AAD, generalmente por calor matando a 70 ° C durante 30 minutos una parte alícuota de las células que se tiñen, lo que agrega una variable adicional al experimento.
• PI podría ser genotóxico / mutagénico para las células (2).
• PI también puede intercalarse con el ARN (3), una cualidad largamente subestimada por la citometría de flujo regular, ya que la evaluación morfológica no es su potencia. OTOH, la Citometría de Flujo de Imágenes más nueva, que combina citometría de flujo con microscopía de fluorescencia, muestra un aumento de la tinción citoplásmica de PI que puede conducir a falsos positivos más altos cuando se usan protocolos de citometría de flujo estándar (4, 5).
• La unión de ARN de PI es la razón por la que se usa RNasa con PI en microscopía (6). Sin embargo, tratar las muestras con RNasa antes de administrarlas en citometría de flujo no es una práctica generalizada (5) ya que la RNasa no penetra las células vivas. También requiere fijación, lo que no funciona para PI.
• Esto nos lleva a la fijación celular y al hecho de que PI solo funciona cuando se utilizan células activas, no fijas, un inconveniente importante ya que la ejecución de células fijas es una gran ventaja de la citometría de flujo de alto rendimiento. Las células se fijan típicamente después de la tinción superficial para permeabilizar sus membranas y teñir adicionalmente las proteínas intracelulares. Dado que PI se une al ADN de forma no covalente , cuando las células se fijan después de la tinción, el colorante unido al ADN de las células muertas podría disociarse e incluso teñir el ADN de la célula viva. Después de todo, la fijación destruye la integridad de la membrana celular.

Ser capaz de usarlos tanto en células vivas como fijas es una razón importante para el cambio en los últimos 10 años de PI y 7AAD hacia los tintes de amina . Colorantes de amina como las combinaciones de colorantes Live / Dead® de Molecular Probes (Invitrogen-Thermo Fisher Scientific)

• También son permeables a la membrana celular , lo que significa que funcionan según el mismo principio, y solo entran en las células con membranas plasmáticas comprometidas.
• Sin embargo, en lugar de unirse al ADN, se unen covalentemente a grupos amina de proteínas celulares. Dichos colorantes, por lo tanto, solo se unirían a las pocas aminas presentes en la superficie celular de las células vivas, pero muchos, muchos más, en las proteínas intracelulares dentro de las células con membranas celulares comprometidas, lo que da como resultado un marcado aumento de la fluorescencia en células muertas / agonizantes / muertas.
• La unión covalente hace que los colorantes amínicos sean impermeables a la fijación celular, lo que significa que permanecen unidos únicamente a aminas de proteínas intracelulares dentro de células que ya estaban muertas para empezar y no se filtrarán para entrar en células previamente vivas, ahora fijadas. Así es como se pueden usar para evaluar la viabilidad incluso en células fijas.
• Están disponibles en una amplia gama de perfiles de excitación y emisión.
• Muchos proveedores ofrecen cuentas reactivas con aminas para usar como control de compensación de marcador de celda muerta.
• A pesar de que sus beneficios son ampliamente superados, las desventajas de los colorantes reactivos con aminas son el tiempo y el paso extra cuando se tiñen las células fijas:
• es necesario teñirlas primero antes de permeabilizar y fijar las células para el protocolo de tinción principal.
• El paso de tinción con colorante amínico debe ir precedido de un paso de lavado con solución salina para eliminar las proteínas libres y minimizar la tinción no específica de la solución utilizada para suspender las células, lo que consumiría el reactivo y dejaría mucho menos disponible para unir aminas de proteínas intracelulares dentro de células comprometidas con la membrana celular.
• Dado que los tintes reactivos con amina se eliminan por lavado antes de realizar los pasos de tinción, rastrean las células que murieron durante el experimento pero no las que mueren durante el proceso de clasificación, cuando se usa citometría de flujo para clasificar subconjuntos de células vivas. Por esta razón y debido a los pasos adicionales, los colorantes clásicos que se unen al ADN, como PI y 7AAD, todavía se prefieren cuando se usa la clasificación por citometría de flujo.

Bibliografía

1. Telford, William, Karen Tamul y Jolene Bradford. “Medición y caracterización de la apoptosis mediante citometría de flujo”. Protocolos actuales en citometría (2016): 9-49.

2. El manual de Sondas Moleculares

3. Deitch, ARLINE D., HORATIO Law y R. deVere White. “Un procedimiento estable de tinción con yoduro de propidio para la citometría de flujo”. Journal of Histochemistry & Cytochemistry 30.9 (1982): 967 – 972. http://journals.sagepub.com/doi/…

4. Rieger, Aja M., et al. “Los ensayos de apoptosis convencionales que usan yoduro de propidio generan un número significativo de falsos positivos que impiden una evaluación precisa de la muerte celular”. Revista de métodos inmunológicos 358.1 (2010): 81-92.

5. Rieger, Aja M. y Daniel R. Barreda. “Evaluación precisa de la muerte celular mediante citometría de flujo de imágenes”. Citometría de flujo de imágenes: métodos y protocolos (2016): 209-220.

6. Fried, Jerrold, Amaury G. Perez y Bayard D. Clarkson. “Análisis citofluorométrico de flujo de distribuciones del ciclo celular usando yoduro de propidio. Propiedades del método y análisis matemático de los datos”. The Journal of cell biology 71.1 (1976): 172-181. http://jcb.rupress.org/content/j…