Si las células animales:
DESCARGO DE RESPONSABILIDAD: No he escrito esta respuesta, no tomo ningún crédito en absoluto, esto solo fue publicado con el único propósito de compartir el conocimiento de internet
Si está hablando de la funcionalidad nucleasa de Cas9, entonces no está agregando el gen Cas9 en el genoma, lo está transfectando en un plásmido.
Habitualmente, se realiza alguna forma de permeabilización a las células, o la construcción se inserta en un vector viral para transfectar las células en un cultivo de tejidos. En animales multicelulares, necesitaría usar la ruta del vector viral como sería necesario hacer con cualquier técnica de terapia genética. Addgene es un repositorio de plásmidos sin fines de lucro que tiene muchas de las construcciones CRISPR / Cas9 que se han desarrollado, y tienen un excelente recurso en su sitio web.
En realidad, no querrías que Cas9 estuviera activo en la celda una vez que haya hecho su trabajo, ya que aumentarás la probabilidad de que ocurra un golpe fuera del objetivo. El objetivo no debería estar en el genoma de todos modos si el evento de focalización ocurrió, porque has sustituido en otro fragmento de ADN o has cortado el ADN y los mecanismos de reparación del ADN han introducido nucleótidos aleatorios para reparar el rompimiento bicatenario.
Las células eucariotas, en su mayor parte, no pueden mantener plásmidos. El gen Cas9 se transcribirá junto con el ARN guía. El complejo proteína / ARN resultante se dirige a la secuencia de interés y realiza un corte. Cuando la célula se replica, es probable que se pierda el plásmido, pero las células hijas heredarán la edición genómica realizada por el evento de selección.
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Si está buscando insertar un gen diferente en el sitio objetivo, diga un informador en el genoma, luego transfectúa conjuntamente un fragmento lineal de ADN con brazos de homología alrededor del sitio de corte para que ese donante se inserte a través de la reparación de ruptura homóloga.
Uno de los constructos de Cas9 que se ha desarrollado ha desactivado la actividad nucleasa, por lo que el complejo Cas9 / ARN termina actuando como una proteína de unión para suprimir la actividad que está buscando estudiar sin eliminar o reemplazar realmente el gen. En este caso, puede intentar insertar el cassette Cas9, en cuyo caso utilizaría un evento de recombinación como lo haría con cualquier otro tipo de incorporación en el genoma.
Respuesta de: AMR
¿Cómo se inserta cas9 en las células animales?
