¿Qué temperatura para la cultura del microorganismo almacenado?

Almacenamiento a corto plazo

Las cepas bacterianas de trabajo pueden rayarse en placas de agar y almacenarse a 4 ° C para uso diario o semanal. Los platos de cultivo deben envolverse con una película de sellado de laboratorio (plástico o parafina) y almacenarse boca abajo (con el agar hacia arriba) para minimizar la contaminación y para mantener tanto el cultivo como el agar bien hidratados. Algunas cepas bacterianas pueden almacenarse durante hasta 1 año a 4 ° C en cultivos de agar de agar, que son especialmente útiles para transportar muestras a otras instalaciones de investigación. Los cultivos de Stab se preparan esterilizando primero agar compatible con cepas (p. Ej., Caldo lisogenético [LB] agar para E. coli) y luego transfiriendo el agar líquido caliente a viales de tapón de rosca usando la técnica aséptica apropiada. Después de que el agar se haya solidificado, se recoge una sola colonia de un cultivo en crecimiento activo usando un alambre estéril y recto. El cable con la bacteria se sumerge luego profundamente en el agar blando varias veces, y el vial se incuba a 37 ° C durante 8-12 horas con la tapa ligeramente suelta. El vial se sella herméticamente y se almacena en la oscuridad a 4 ° C.

Almacenamiento a largo plazo

Como se mencionó anteriormente, la temperatura a la que se almacenan las bacterias congeladas afecta cuánto tiempo se pueden almacenar sin dejar de ser viables. Congelar y descongelar las celdas a una velocidad adecuada y mantener las reservas congeladas a la temperatura de almacenamiento adecuada ayudan a minimizar el daño del proceso de congelación. Además, cuanto mayor es la densidad celular, mejor es la recuperación después de descongelar las células. Para la mayoría de las bacterias, una densidad de 10 células / ml dará como resultado una recuperación adecuada si todas las condiciones se mantienen adecuadamente.

Crioprotectores: como el agua en las células se convierte en hielo, los solutos se acumulan en el agua residual libre. Este aumento localizado en la concentración de sal puede desnaturalizar biomoléculas.

Además, la formación de cristales de hielo puede dañar las membranas celulares. Los aditivos que se mezclan con la suspensión bacteriana antes de la congelación reducen el punto de congelación y protegen las células durante la congelación para minimizar los efectos perjudiciales de una mayor concentración de solutos y la formación de cristales de hielo. Los crioprotectores más comúnmente usados ​​son el dimetilsulfóxido (DMSO) y el glicerol, que se usan típicamente al 5-15% (v / v). Los aditivos no permeables utilizados como crioconservantes, como los polisacáridos, las proteínas y los dextranos, se adsorben en la superficie de los microorganismos y forman una capa viscosa que protege las membranas, haciendo que estos agentes sean particularmente útiles para la crioconservación. Otros aditivos de uso común incluyen suero sanguíneo, etilenglicol, metanol, leche desnatada, extractos de levadura y tripticasa de soja.

Muestras de congelación: para preparar las reservas de glicerol, el glicerol primero se esteriliza en autoclave y se deja enfriar. El volumen apropiado de glicerol se agrega a una suspensión de bacterias de fase logarítmica y se agita en vórtex para disociar las células y garantizar una mezcla uniforme de las bacterias con el glicerol. Después de alicuotar la suspensión en viales de tapón de rosca criogénicos, las células se congelan instantáneamente sumergiendo los tubos en etanol-hielo seco o nitrógeno líquido y luego almacenados en congeladores (-20 a -80 ° C) o nitrógeno líquido (-150 DO).

La descongelación y la recongelación repetidas de las reservas bacterianas reducirán la viabilidad celular y deben evitarse. Al recuperar cepas con marcadores de selección de antibióticos, cultivarlas en medios selectivos asegurará que las reservas bacterianas no estén contaminadas.

Liofilización: las bacterias se pueden liofilizar suspendiendo células de fase logarítmica en un medio de liofilización y luego liofilizando la suspensión. No todas las bacterias se pueden liofilizar con éxito.

Ciertas cepas pueden no sobrevivir al proceso o morir rápidamente una vez liofilizado. La mejor manera de determinar si una cepa es susceptible de liofilización es evaluar empíricamente su estabilidad después de la liofilización mientras se mantiene una cultura viva como respaldo. Una vez liofilizado, es mejor almacenar la bacteria a 4 ° C o menos.