¿Cuál es el proceso (incluido el procedimiento de laboratorio, el aparato y los recursos) para usar CRISPR para cambiar el genoma de E. coli?

Dirigir las nucleasas a secuencias de ADN específicas facilita la edición del genoma. El trabajo reciente demostró que la nucleasa (Cas) nucleasa Casis asociada a CRISPR puede dirigirse a secuencias in vitro simplemente modificando una guía de ARN CRISPR corta7 (crRNA). El sistema CRISPR-Cas utiliza para introducir mutaciones libres de marcador en Escherichia coli en el cual este enfoque implica reprogramar Cas9 usando un crRNA complementario a un locus cromosómico diana e introducir un molde de ADN que alberga una mutación deseada y un sitio de reconocimiento de crRNA alterado para recombinación con el locus objetivo. Esto analiza de forma exhaustiva los requisitos del objetivo Cas9 para definir el rango de secuencias orientables y muestra estrategias para editar sitios que no cumplen estos requisitos. Solo o junto con la recombinación, la edición asistida por CRISPR induce la recombinación en el locus objetivo y elimina las células no editadas, lo que lleva a una recuperación de cerca del 100% de las células editadas. Se puede usar múltiples crRNA para modificar varios loci simultáneamente. La edición del genoma mediado por CRISPR requiere la programación de las secuencias de crRNA y plantilla y constituye una herramienta útil para la ingeniería genética.