Sí, CRISPR en microbiología es un tema candente. Puede dividir aproximadamente el trabajo en dos categorías superpuestas: desarrollar CRISPR como una herramienta para microbiología y comprender la biología de CRISPR.
Desarrollando CRISPR como una herramienta para microbiología.
Un aspecto realmente asombroso de la edición de genoma basada en CRISPR con Cas9 completamente activo es que parece funcionar en todos los sistemas biológicos en los que se ha probado. Sin embargo, requiere un ajuste en cada sistema: una dosis demasiado alta de Cas9 y la célula puede ser asesinado.
También se han realizado esfuerzos para emplear versiones de ingeniería de Cas9 para hacer otras cosas, aunque esto ha retrasado el esfuerzo en humanos y ratones. Estos generalmente usan versiones mutantes de Cas9 en las cuales las dos actividades de nucleasa han sido inactivadas. Si esa proteína se dirige simplemente a un promotor, entonces puede actuar como un represor (un enfoque a veces denominado CRISPRi) simplemente bloqueando el acceso de la ARN polimerasa al promotor. Ha habido un documento (del laboratorio de Anne Hochschild) que muestra que en E. coli una fusión de nucleasa muerta Cas9 con la subunidad omega de la ARN polimerasa crea un activador programable; en efecto, el sitio al que apunta el ARN guía se convierte en un promotor.
Pero no he visto ningún documento que use Cas9 químico o controlable a la luz en un entorno bacteriano ni la edición más suave disponible fusionando la cas9 nucleasa muerta con la citidina desaminasa, que genera mutaciones C → T en las inmediaciones del sitio objetivo.
Otra aplicación que se ha explorado es utilizar Cas9 para dirigirse específicamente a bacterias patógenas o elementos de virulencia dentro de ellos (incluidos los elementos de resistencia a antibióticos). Hay una empresa francesa que persigue esta tecnología. Como con todos los agentes antibacterianos hiperespecíficos, un desafío es que la determinación de la bacteria específica que infecta a un paciente es un proceso lento. Entonces, tal enfoque podría ser interesante en infecciones crónicas, pero no útil para infecciones agudas que podrían matar rápidamente a un paciente.
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Comprender la biología de CRISPR
Tal vez el mayor esfuerzo en este espacio se superpone con el espacio anterior: la búsqueda de más sistemas CRISPR. El laboratorio de Feng Zhang en el Broad Institute tiene un programa muy activo que busca enzimas con actividad tipo Cas9 pero que son distintivas, como tener una secuencia diferente de tracrRNA o PAM, mayor especificidad o una proteína más pequeña. Esto último se debe a que el Cas9 que se descubrió por primera vez es una proteína enorme y difícil de empacar en vectores virales para uso humano. Diferentes PAM permiten dirigir sitios que no están cerca del PAM para el Cas9 existente. Diferentes tracrRNA significa que pueden dirigirse independientemente a múltiples sistemas similares a Cas9 en la célula, por lo que es posible que tenga activadores, represores, editores, modificadores epigenéticos, etc., que son independientes entre sí.
También existe la búsqueda general de sistemas anti-CRISPR en bacterias y fagos, que serían útiles para controlar CRISPR pero también son valiosos para comprender en el contexto biológico.
Si bien estos enfoques pueden derivar nuevas herramientas, esto también es biología básica. Nos gustaría entender cómo evolucionan los sistemas CRISPR y cuántos riffs diferentes sobre el tema la naturaleza ha cocinado. Puede haber otros sistemas efectores (como los que se dirigen al ARN en lugar del ADN, creo que algunos ya han aparecido). Esas herramientas serían intrínsecamente interesantes y potencialmente valiosas.
También está toda la cuestión de la dinámica evolutiva de los sistemas CRISPR y los beneficios y costos. Muchas bacterias se arreglan sin los sistemas CRISPR. Presumiblemente hay compensaciones de aptitud, entonces, ¿qué son? ¿Hay alguna lógica a la cual las bacterias llevan CRISPR y cuáles no? ¿Cómo se ve la dinámica de CRISPR en poblaciones de bacterias estrechamente relacionadas? ¿Y cómo ha respondido fagos al desafío? Los sistemas Anti-CRISPR son una excepción, pero ¿hay otros?