La extracción de ADN tiene algunos principios clave. Existen numerosas variaciones dependiendo de la muestra de entrada, el equipo disponible (es decir, la preparación de laboratorio frente al campo) y la calidad necesaria. Para este último, ¿tiene un uso final que puede tolerar ADN fragmentado relativamente corto, como PCR, microarrays o secuenciación de lectura corta (Illumina, Sanger, Ion Torrent), o necesita ADN de alto peso molecular para clones BAC, ópticos? mapeo, secuencia de lectura enlazada (10X genómica) o secuenciación de lectura larga (PacBio, Oxford Nanopore)?
En primer lugar, debe liberar el ADN de los distintos niveles de compartimentalización celular. Para las células con una pared celular (bacterias a excepción de micoplasmas, arqueas, hongos, plantas) necesita atravesar eso. Entonces necesitas romper la membrana celular y, si es un eucariota, también la membrana nuclear. Las nucleasas presentes en la célula deben ser inactivadas rápidamente. Las proteínas que están unidas al ADN deben ser eliminadas. Todo lo que no es ADN debe ser eliminado.
Para atravesar paredes celulares, básicamente tienes dos opciones. Los métodos mecánicos son típicamente golpes de cuentas: la muestra se mezcla con diminutas esferas de vidrio o metal y se agita violentamente. Esto romperá cualquier célula, pero fragmenta el ADN y también puede causar daño por calor. Los métodos de congelación-descongelación, que incluyen congelar las muestras en nitrógeno líquido y luego molerlas con un mortero, también pueden romper casi cualquier cosa. Los métodos enzimáticos típicamente deben ajustarse a la especie particular, lo que los hace problemáticos para las muestras metagenómicas. Pero los métodos enzimáticos ofrecen la posibilidad de ADN.
Las membranas son lípidos, por lo que los detergentes tienen sentido. Se puede ver una amplia gama de detergentes en los protocolos típicos. SDS, el ingrediente principal en muchos detergentes domésticos, es muy efectivo pero puede ser problemático para los pasos posteriores y difícil de eliminar. Los detergentes no iónicos como el CTAB también son comunes.
Hay una serie de enfoques para inactivar nucleasas. El tratamiento térmico es uno. Agregar un agente quelante de cationes divalentes como EDTA es útil, pero una vez más, debe sacar todo esto o se inhibirán sus reacciones de biología molecular.
Las proteasas a menudo se encuentran en cócteles de lisis para destruir proteínas en la célula, particularmente las unidas a ADN o nucleasas. La RNasa en el tampón de lisis comenzará a destruir el ARN. Los agentes caotrópicos como las sales de guanidinio desplegarán proteínas.
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Eliminar todos los contaminantes puede ser difícil, dependiendo de la fuente de muestra. La extracción de fenol-cloroformo utiliza sustancias químicas peligrosas y es un proceso manual, pero hace un excelente trabajo al eliminar las proteínas y los lípidos. Las columnas o perlas con geles de sílice o materiales similares unirán el ADN bajo altas resistencias iónicas y lo liberarán en tampones de baja fuerza iónica; esta es una forma común de deshacerse de muchos contaminantes y las versiones de cuentas se automatizan muy bien (utilizando cuentas con un núcleo magnético). El uso de la electroforesis para separar suavemente el ADN de alto peso molecular de los contaminantes es el método utilizado en un nuevo instrumento en el mercado (SageHLS: Preparación automática de ADN uHMW). La precipitación de ADN con etanol frío (o isopropanol) es otro método, y proporciona una experiencia de entrenamiento espectacular al tirar de la mezcla las hebras de ADN que parecen mocos.
Algunos contaminantes son realmente difíciles. El hemo de la sangre es un inhibidor muy potente de muchas de las polimerasas utilizadas para la PCR, aunque existen versiones evolucionadas artificialmente disponibles de algunos proveedores que son más resistentes. Las muestras de suelo contienen ácidos húmicos (compuestos polifenólicos), que también son difíciles de separar de las muestras y pueden causar problemas. Los microorganismos inusuales y muchas plantas a veces tienen metabolitos secundarios inusuales que se adhieren ferozmente al ADN (tengo, por desgracia, experiencia directa con ese problema).
Hay todo tipo de variaciones para fines específicos; He delineado algunos temas generales. Por ejemplo, a veces se desea aislar núcleos o cromatina intacta o incluso cromosomas casi intactos, por lo que existen enfoques especiales para hacerlo. También hay preparaciones que preservan deliberadamente el ARN y ahora incluso algunas que intentan no eliminar por completo la proteína para que pueda obtener ADN, ARN y proteínas, todo desde una preparación.
Los avances en los métodos de preparación de ADN, particularmente para aplicaciones largas de ADN o de campo, son un tema recurrente en mi blog ¡Omics! Omics!
