Técnicas de laboratorio en biología: al hacer una colonia de PCR, ¿cuáles son sus opciones si las células no se rompen cuando las hierve durante cinco minutos?

Las estrategias viables dependen de la cantidad de células con las que comienzas, lo cual, por la pregunta, no parece mucho. Lo primero que intentaré es el tratamiento con proteinasa K seguido de la ebullición: esto debería masticar las glicoproteínas en la pared de la célula lo suficiente como para romper las células cuando hierves. La ebullición es CRÍTICA para este enfoque, ya que inactiva la proteinasa K (que de lo contrario también comería su polimerasa).

Otra posibilidad es el tratamiento con un detergente no iónico como igepal o Triton-X. Las concentraciones entre 0,5 y 1% son suficientes para abrir la mayoría de las células, pero es probable que deba asegurarse de que su polimerasa pueda funcionar con detergente.

Si eso no funciona, es posible que desee considerar la ampliación de su crecimiento y hacer una extracción de fenol cloroformo seguida de precipitación con etanol para purificar tanto el ADN genómico como cualquier plásmido que pueda estar presente. Si está explorando una gran cantidad de colonias para captar un plásmido (o algo similar), esto probablemente sea doloroso.

Con Streptomyces, que son Gram + y difíciles de romper, tendemos a hervir una colonia fresca en agua o DMSO durante 10 minutos … cuando esto no funciona (no siempre), generalmente vamos por una genómica Preparación de ADN como sugirió Brian. No estoy seguro de si el tiempo de ebullición ligeramente más prolongado funcionaría para Planctomycetes; podría intentar consultar con alguien que trabaje con ellos.