Prefacio: si en realidad tiene la intención de diseñar un experimento basado en las respuestas aquí, ¡asegúrese de consultar con colegas calificados y otros expertos también!
No hay muchas opciones para una inserción tan grande. Una cosa importante que debe mencionarse es que algunos mecanismos colocan el inserto en una ubicación aleatoria, mientras que otros pueden dirigirse a una determinada región (más o menos).
El método más básico para la inserción de ADN extraño es el mismo método utilizado para preparar un Cromosoma Artificial Bacteriano (BAC):
1) Exponer el cromosoma objetivo (en la bacteria) a una cantidad suficiente de una endonucleasa de restricción específica (p. Ej., EcoRI, MseI, AscI, BamV, etc.).
2) Asegúrese de que su inserción tenga el mismo tipo de extremos adhesivos creados por la endonucleasa de restricción elegida.
3) Inyecte su inserción en la bacteria y exprese DNA Ligase (generalmente DNA Ligase IV) para que el inserto se ligue en la región deseada del cromosoma objetivo.
Tener un genoma de referencia para la bacteria es muy importante aquí si quieres insertarlo en una región muy específica. Podrá elegir la endonucleasa de restricción óptima para el trabajo al tener el genoma de referencia, y puede diseñar la inserción para que solo se seleccione la inserción de destino correcta en una pantalla adicional (por ej. Anteponer un reportero a su inserción si hay un promotor inducible cadena arriba del sitio del extremo adhesivo en el cromosoma objetivo, y asegúrese de que los sitios de inserción alternativos no tengan promotores cadena arriba que se inducen de la misma manera).
¿Por qué la mayoría de los hombres son de sangre caliente?
La sangre pasa a través de las arterias y venas. Si es así, ¿por qué sangramos cuando nos duele?
Si está intentando hacer esto para E. coli, ya hay una buena técnica disponible llamada “Asamblea de Gibson”: https://www.neb.com/applications…
80 kb es una inserción sustancialmente grande. Muchas otras técnicas (por ejemplo, CRISPR / Cas9 o TALEN seguidas por la reparación de Recombinación homóloga) son tan ineficientes para inserciones tan grandes que se consideran inútiles. No estoy tan familiarizado con las limitaciones de los rAAV u otros métodos retrovirales.
Puede considerar reducir el inserto o generar progresivamente líneas transgénicas que se acerquen a un transgénico con su inserción prevista (por ejemplo, use CRISPR / Cas9 + HR con reducción de lig4 para insertar un par de exones a la vez).
