¿Cuál es la longitud de onda adecuada para medir cultivos de células de levadura en un colorímetro?

Las células de levadura cultivadas en cultivo líquido se pueden analizar utilizando la especificación como una herramienta para evaluar el crecimiento de las células en el medio. Al hacer esto, NO estamos midiendo la concentración de ninguna sustancia en particular, sino que estamos viendo la dispersión de la luz causada por las células que crecen en la solución.

A medida que las células crecen, la turbidez (es decir, “nubosidad”) de la solución aumenta y la cantidad de luz dispersa se puede utilizar para determinar la densidad del cultivo.

Adaptado del protocolo Appling Lab para Growth Curves.

1. 1. Inicie un cultivo de 5 mL de YPD e incube las células durante la noche a 30 ° C (~ 16 horas).
2. 2. Al día siguiente, tome una medida OD600.
   Nota: Necesitará diluir su cultivo nocturno (probablemente de 1 a 5) para tomar una medida precisa. Ver el protocolo para usar el espectrofotómetro 20D +. No puedo enfatizar suficientemente lo importante que es esta dilución de 1 a 5 cuando se usa el 20D + para medir el OD de su cultura nocturna. El 20D + no puede medir con precisión un cultivo saturado. Por lo tanto, el cultivo debe diluirse, medirse y luego cuantificarse según el factor de dilución utilizado.
3. 3. Calcule la cantidad de cultivo de una noche requerida para comenzar un nuevo cultivo de YL de 20 ml a una DO600 de 0.05 usando la ecuación S1 × V1 = S2 × V2.
   ¡Recuerde su dilución en el paso 2 para este cálculo!
4. 4. Combinar esta cantidad calculada de cultivo durante la noche con YPD fresca para comenzar un nuevo cultivo a una DO600 de ~ 0.05.
5. 5. Tome una lectura OD600. Esta es la “Hora 0” (medición real).
6. Nic.at Kurzdomains intervalos regulares (varía por organismo y cepa) tomar mediciones de OD600 en ambas culturas y continuar haciéndolo hasta que la tasa de crecimiento se estabilice.

Una curva de crecimiento típica se muestra a continuación:

Desarrollado por

Andrew Hertsenberg y Monica Noori

Usando el espectrofotómetro 20D +

Perilla izquierda = 0% T Perilla derecha = 100% T

Cubetas

1. 1. Encienda el instrumento girando el dial 0% T en el sentido de las agujas del reloj.
   Debería escuchar que hace clic cuando se enciende.
2. 2. Permita que la especificación se caliente durante al menos 15 minutos.
   Dado el largo tiempo de calentamiento, es probable que dejemos este dispositivo encendido durante los períodos de uso intensivo. No apague el dispositivo si es probable que otros usuarios lo utilicen.
3. 3.Después del período de calentamiento, ajuste la longitud de onda a 600 nm (botón superior).
4. 4. Coloque la palanca del filtro en la posición adecuada para la longitud de onda seleccionada (abajo).
5. 5. Presione el botón MODE hasta que el modo de visualización esté configurado en FACTOR.
6. 6.Utilizando los botones de AUMENTAR / DISMINUIR asegurar que el factor se establece en 1.0.
7. 7. Presione el botón MODE hasta que el modo de visualización esté configurado en TRANSMITTANCE.
8. 8. Sin una cubeta en el soporte y la tapa cerrada, gire la perilla 0% T hasta que la transmitancia medida sea 0.0. Esto está poniendo a cero el dispositivo.
9. 9.Llene una cubeta con 3,0 ml del medio utilizado para hacer crecer las células (por ejemplo, YPD) y limpie los lados con un KimWipe para eliminar las huellas dactilares y las partículas de polvo.
10. 10. Coloque la cubeta en el compartimento.
11. 11. Alinee la marca de guía de la cubeta con la marca de guía en el compartimiento.
12. 12.Cierre la tapa del compartimento.
13. 13. Ajuste la TRANSMITTANCE a 100.0 con el control 100% T (derecha).
    Esto es esencialmente el equivalente a cuando TARE un saldo.
14. 14.Quita la muestra.
    Puede optar por abandonar esta cubeta de YPD para otros usuarios, ya que es probable que realicen el mismo procedimiento. Nota: el espectrofotómetro debe estar en blanco para cada usuario, incluso si se utiliza una cubeta común.
15. http://15.In una nueva cubeta agregue 3.0 mL de su muestra de cultivo celular.
    NOTA IMPORTANTE: debe asegurarse de girar su cultivo celular para asegurarse de que sea homogéneo antes de agregarlo a una cubeta. También tenga en cuenta que una cultura sentada en una cubeta tiende a asentarse. En general, tenga en cuenta que desea que su medida represente la cultura que ha cultivado. Esto, mezclar y arremolinar es la clave.
16. 16. Limpie la celda con una KimWipe e insértela en el compartimento como se muestra en el Paso 10.
17. 17. Registre el valor que se muestra en la pantalla de datos (asegúrese de que MODE sea ABSORBANCE).
    La absorbancia es un sinónimo de OD (densidad óptica).
18. 18. Cuando se obtengan todas las medidas, gire el O% T (mando a la izquierda) en el sentido contrario a las agujas del reloj para desactivar la función.
19. 19.Limpie bien sus cubetas y séquelas por completo.

Desarrollado por

Andrew Hertsenberg y Monica Noori

Usando el NanoDrop ND-1000

Propósito y objetivo

El objetivo del espectrofotómetro NanoDrop es cuantificar la concentración de su solución de ácido nucleico mientras solo se usa una cantidad muy pequeña de su muestra. Usando solo 2 μl de su muestra, puede determinar la concentración de su muestra en ng / μl usando la absorbancia de la luz.

Operación general

El NanoDrop consta de dos partes importantes: el pedestal y el brazo de muestreo (Fig. 1). Durante la operación, la muestra se colocará en el pedestal y el brazo de muestreo se bajará antes de realizar la medición. Cuando se inicializa la medición, el brazo de muestreo y el pedestal extenderán la gota de muestra y enviarán luz a través de la muestra (Fig. 2). La absorbancia a 260 nm será tomada por el espectrofotómetro y será enviada a la computadora.

Figuras:

Componentes generales

La columna que se forma durante la operación.

Seleccionar las opciones del programa de Ácido Nucleico o Cultivo Celular.

Limpiando el pedestal.

Después de cargar agua, haga clic en Aceptar.

La pantalla de medición de Ácido Nucleico.

El resultado de la cuantificación del Ácido Nucleico.

El resultado de la cuantificación del cultivo celular.

Protocolo de cultivo celular

1. 1. Con el brazo de muestreo en la posición inferior, abra el programa NanoDrop con el icono en el escritorio y se abrirá la pantalla de la Figura 3.
2. 2. Seleccione la opción Cultura de celda en esta pantalla y aparecerá una nueva pantalla similar a la de la Figura 6.
3. 3.Levante el brazo de muestreo y tome una KimWipe que esté ligeramente mojada con diH2O y limpie tanto el pedestal como el brazo de muestreo para evitar la acumulación de residuos en el aparato. (Figura 4 arriba).
4. 4. Usando una micropipeta L20, coloque una gota de 2 μl de diH2O en el pedestal y baje el brazo de muestreo. Esto se hace típicamente presionando ligeramente el émbolo y permitiendo que se forme una gota del líquido en el extremo de la pipeta. Esta caída es mucho más fácil de colocar en el pedestal. Baje el brazo de muestreo suavemente y no presione el pedestal.
5. 5. Haga clic en “Aceptar”.
6. 6. Ahora deberá dejar en blanco el NanoDrop para que se lea una medición de línea base de “0” antes de comenzar.
7. 7. Limpie el pedestal y el brazo de muestreo con un KimWipe.
8. 8.Agregue una gota de 2 μl del líquido en el que creció la levadura, YPD.
9. 9. Baje el brazo de muestreo suavemente y haga clic en “En blanco”.
10. 10.Vuelva a limpiar el pedestal y el brazo de muestreo con un KimWipe.
11. 11.Agregue 3 μl de la muestra objetivo y haga clic en “Medir” (que se encuentra en la esquina superior izquierda de la pantalla).
12. 12.Tome una lectura de la pantalla del número que resulta en 600 nm abs.
13. 13. Limpie la muestra del pedestal y del brazo con un KimWipe y deje el brazo en la posición baja. ¡Limpia el pedal completamente!
14. 14. Salga del programa o repita los pasos 10 a 12 para muestras adicionales.

Protocolo de ácido nucleico

1. 1. Con el brazo de muestreo en la posición inferior, abra el programa NanoDrop con el icono en el escritorio y se abrirá la pantalla de la Figura 3.
2. 2. Seleccione la opción Ácido nucleico en esta pantalla y aparecerá una nueva pantalla similar a la de la Figura 6.
3. 3.Levante el brazo de muestreo y tome una KimWipe que esté ligeramente mojada con diH2O y limpie tanto el pedestal como el brazo de muestreo para evitar la acumulación de residuos en el aparato. (Figura 4 arriba).
4. 4. Usando una micropipeta L20, coloque una gota de 2 μl de diH2O en el pedestal y baje el brazo de muestreo. Esto se hace típicamente presionando ligeramente el émbolo y permitiendo que se forme una gota del líquido en el extremo de la pipeta. Esta caída es mucho más fácil de colocar en el pedestal. Baje el brazo de muestreo suavemente y no presione el pedestal.
5. 5. Haga clic en “Aceptar”.
6. 6. Ahora deberá dejar en blanco el NanoDrop para que se lea una medición de línea base de “0” antes de comenzar.
7. 7. Limpie el pedestal y el brazo de muestreo con un KimWipe.
8. 8.Desde la nueva pantalla (Fig. 6), seleccione la opción de ADN o ARN dependiendo de la muestra que se mide en la esquina superior derecha de la ventana. Agregue una gota de 2 l del líquido en el que se resuspendió el ADN o el ARN, generalmente diH2O o Tris.
9. 9. Baje el brazo de muestreo suavemente y haga clic en “En blanco”.
10. 10.Vuelva a limpiar el pedestal y el brazo de muestreo con un KimWipe. Agregue 2 μl de la muestra objetivo y haga clic en “Medir”, que se encuentra en la esquina superior izquierda. (Fig.7)
11. 11.Tome una lectura desde la esquina inferior derecha (Fig.7) en ng / μl.
12. 12.Limpie el brazo de muestreo y el pedestal con un KimWipe después del uso y déjelo con el brazo de muestreo en la posición hacia abajo. ¡Limpia el pedestal muy bien!
13. 13. Salga del programa o repita los pasos 10 a 12 para muestras adicionales.

Desarrollado por

Michael Gonzales y Kristy Moryan

Manchado de placa

Introducción

La mancha de placa es una técnica utilizada para estudiar el crecimiento de una levadura sobre una superficie sólida (una placa). Normalmente se usa para estudiar el crecimiento relativo de múltiples cepas de levadura en una superficie de crecimiento común. Las diluciones en serie de cada cultivo se realizan de modo que cada fila represente una deformación, mientras que cada columna representa una dilución. Se usan diluciones porque puede ser difícil separar una cepa de crecimiento débil de tipo salvaje a altas concentraciones celulares.

Procedimiento

Esto se hace tomando un cultivo de levadura (o múltiple), haciendo una serie de diluciones en serie y plaqueándolas (en “manchas”) en un plato. Para el siguiente ejemplo, damos detalles para plaquear una cepa (una fila). El procedimiento se realizaría varias veces para cada cepa que necesita ser co-plateado.

Primero debes hacer las placas sobre las que plaquearás tus células.

A continuación, debe preparar 100 μl de diluciones en serie de un cultivo celular durante la noche.

Es probable que desee crear:

1. ‣Tube 1 – 1/1
2. ‣Tube 2 – 1/10
3. ‣Tube 3 – 1/100
4. ‣Tube 4 – 1/1000
5. 1.Tome 5 μL del Tubo 1 y pipetee sobre la placa.
   Intenta colocar la gota aproximadamente a media pulgada del centro y hacia el lado izquierdo del plato, ya que vas a colocar las siguientes dos gotas a la derecha de este y en línea recta a través del plato.
6. 2.Tome 5 μL del Tubo 2 y pipetee sobre la placa aproximadamente media pulgada a la derecha del punto del Tubo 2.
7. http://3.Haga lo mismo para el Tubo 3, y colóquelo a la misma distancia del punto del Tubo 2 que el punto del Tubo 2 del punto del Tubo 2.
8. 4. Puede usar esta placa para medir tantas diluciones como desee, siempre que las espacie y las mantenga en orden secuencial.
9. 5. Coloque la placa en la incubadora adecuada para el crecimiento.

Una vez que los platos crezcan de la noche a la mañana, se verán como en la figura siguiente.

1. ‣ Las columnas se correlacionan con tubos (Tubos 1, 2, 3 y 4 en este caso).
2. ‣Las filas son diferentes cepas crecimiento al mismo tiempo.
3. ‣Podría decir que las cepas A, C y D crecieron mejor que las cepas B y E.
4. ‣ ¿Puedes verlo (especialmente en la última dilución)?

De una publicación de Hu, Killion Nature Genetics de 2007:

Los defectos de crecimiento de las cepas de inactivación del factor de transcripción recientemente predichas por el análisis de sobrerrepresentación GO de la red refinada. YPD es medio rico, y SD es un medio mínimo sintético con dextrosa, uracilo, histidina, metionina y leucina. Se predijo que Aft1 activaría los genes chaperones, y la cepa aft1D es defectuosa para crecer a 37 1C. Se predijo que Rtg3 activaría la biosíntesis de glutamato, y la cepa rtg3D es defectuosa para el crecimiento en un medio mínimo. De las cinco cepas que probamos, bas1D, ric1D y pho2D no mostraron un defecto de crecimiento correspondiente; solo bas1D se muestra aquí.