¿Es posible extraer mi ADN de mis células ciliadas?

Extracción de ADN de la muestra de cabello

El ADN se aisló de los tallos del cabello usando versiones modificadas del protocolo de extracción de disolvente orgánico y molienda de vidrio microscópico.

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Como estos protocolos exponen a la muestra a mayores riesgos de contaminación, el presente estudio ha reemplazado el tedioso método de digestión física con un método de digestión química suave usando ditiotreitol (DTT) (Hi-media) ya que es un agente reductor fuerte con contenido de sal relativamente alto. y también un detergente aniónico. Se añadió tampón de digestión (500 μl, Tris-HCl 10 mM, EDTA 10 mM, NaCl 50 mM, SDS al 20%, pH 7,5) a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, junto con 40 μl de DTT 1 M (hasta una concentración final). de ~ 80 mM, 240 mM de acetato sódico, pH 5,2) y 15 μl de 10 mg / ml de proteinasa K (hasta una concentración final de ~0,3 mg / ml; Himedia). Se añadió muestra de cabello a esta solución antes de agitar en vórtex e incubar durante 2 horas a 56 ° C. Después de 2 h de incubación, el tubo de muestra se agitó de nuevo con vórtex y se añadieron 40 μl adicionales de DTT 1 M y 15 μl de proteinasa K 10 mg / ml, seguido de una mezcla suave e incubación a 60 ° C durante 2 h más hasta que el cabello se haya disuelto por completo

A continuación, se extrajo el ADN de cada muestra con un volumen igual de solución de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25: 24: 1) y se mezcló suavemente invirtiendo el tubo durante unos minutos. Las muestras se centrifugaron (Eppendorf 5415R) durante 10 minutos con 10.000 g (4 ° C), seguido de la transferencia de la capa acuosa superior en un tubo de microcentrífuga esterilizado nuevo. Se añadió RNasa A (10 \ mu l de 10 mg / ml; Fermentas, Thermo Scientific) y se mantuvo para la incubación a 37ºC durante 30 minutos. Se añadió un volumen igual de cloroformo: alcohol isoamílico, y el tubo se centrifugó (Eppendorf 5415R) nuevamente a 10.000 g (4ºC) durante 10 minutos. La capa acuosa superior se transfirió a un tubo de microcentrífuga esterilizado nuevo, antes de que se añadiera el doble del volumen de isopropanol enfriado y un décimo de volumen de acetato sódico 3M. La muestra se enfrió a -20 ° C durante 1 h para que ocurriera la precipitación de ADN. La muestra se centrifugó (Eppendorf 5415R) a 10.000 g (4 ° C) durante 10 min. El sobrenadante se descartó, se añadieron 250 μl de etanol al 70% y el gránulo se golpeó suavemente antes de una centrifugación adicional (Eppendorf 5415R) a 10.000 rpm durante 10 min. El sobrenadante se descartó, y el sedimento se secó al aire en un flujo de aire laminar, se resuspendió en 50 μl de agua sin nucleasas o 1x tampón TE y se congeló a -20 ° C o -80 ° C para su almacenamiento.

RESULTADOS

En el presente estudio, demostramos un método rápido, confiable y robusto para obtener ADN genómico preparado para PCR a partir de hisopos bucales humanos, cabello y muestras de orina, demandando un volumen de muestra muy bajo con un tiempo de aislamiento / amplificación que es, al menos, un factor de dos más corto en comparación con los métodos convencionales. La sangre se utilizó como muestra de referencia para el aislamiento del ADN. Al modificar el método convencional de fenol-cloroformo, también desarrollamos y demostramos con éxito un protocolo confiable que es rápido, rentable y fácil de implementar para el aislamiento del ADN con una concentración y pureza óptimas.

A continuación, se extrajo el ADN de cada muestra con un volumen igual de solución de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25: 24: 1) y se mezcló suavemente invirtiendo el tubo durante unos minutos. Las muestras se centrifugaron (Eppendorf 5415R) durante 10 minutos con 10.000 g (4 ° C), seguido de la transferencia de la capa acuosa superior en un tubo de microcentrífuga esterilizado nuevo. Se añadió RNasa A (10 \ mu l de 10 mg / ml; Fermentas, Thermo Scientific) y se mantuvo para la incubación a 37ºC durante 30 minutos. Se añadió un volumen igual de cloroformo: alcohol isoamílico, y el tubo se centrifugó (Eppendorf 5415R) nuevamente a 10.000 g (4ºC) durante 10 minutos. La capa acuosa superior se transfirió a un tubo de microcentrífuga esterilizado nuevo, antes de que se añadiera el doble del volumen de isopropanol enfriado y un décimo de volumen de acetato sódico 3M. La muestra se enfrió a -20 ° C durante 1 h para que ocurriera la precipitación de ADN. La muestra se centrifugó (Eppendorf 5415R) a 10.000 g (4 ° C) durante 10 min. El sobrenadante se descartó, se añadieron 250 μl de etanol al 70% y el gránulo se golpeó suavemente antes de una centrifugación adicional (Eppendorf 5415R) a 10.000 rpm durante 10 min. El sobrenadante se descartó, y el sedimento se secó al aire en un flujo de aire laminar, se resuspendió en 50 μl de agua sin nucleasas o 1x tampón TE y se congeló a -20 ° C o -80 ° C para su almacenamiento.

Puede obtener ADN mitocondrial del eje. Si bien esto contiene muy poca información en comparación con el núcleo, es útil en la genealogía, ya que se hereda estrictamente a través de la línea materna.

No puedes extraer ADN de la parte del pelo que ves, porque esa parte está muerta y no tiene ADN, por lo tanto, tu experimento no tendrá éxito

El ADN se puede extraer de un cabello solo si tiene una raíz del cabello adherida.