¿Cómo recogen los potenciales de retención los investigadores cuando realizan experimentos de fijación de tensión?

Por mucha experiencia, la mayoría de los cuales no se explicarán en un documento. Al igual que cualquier campo de especialistas, muchos fisiólogos esperan que los lectores comprendan muchas de las razones subyacentes sin explicarlas. ¡Eso lo hace difícil cuando solo estás aprendiendo! Lleva un tiempo conocer todas las consideraciones, por lo que no es sorprendente que a menudo se encuentre confundido en este punto.

Mi regla más general para elegir un potencial de retención es aproximar el potencial de reposo natural de la célula, en la teoría de que la célula es “más feliz” y sobrevivirá más tiempo a este potencial. Pero esto es solo para mantener la célula saludable entre los experimentos. Mientras realizo un experimento, hay muchas consideraciones sobre cómo diseñar el protocolo.

Aquí hay un resumen general de mi proceso de pensamiento cuando estoy diseñando un protocolo de abrazadera de voltaje para estudiar una neurona.

1) ¿Qué estoy tratando de mostrar? ¿De qué estado quiero que empiece el sistema / célula? ¿Quiero comenzar con la corriente completamente activada, completamente desactivada o inactiva, o realmente no importa (simplemente midiendo los tamaños actuales de corriente)?

2) ¿Cuál es la dependencia del voltaje de la (s) corriente (s) que estoy estudiando? Dadas las respuestas a estas dos preguntas juntas, tengo una muy buena idea de cómo establecer el potencial de retención. Tenga en cuenta que dependiendo de mis respuestas, podría elegir un lugar donde haya muy poca corriente (completamente desactivado o inactivado) o podría elegir un lugar donde exista el más actual (totalmente activado).

Pero luego también empiezo a pensar en …

3) Las condiciones de mi experimento. El tipo de celda, la temperatura, la solución interna, la solución externa y el método de preparación de la celda tendrán un efecto en los voltajes que uso. Algunas preguntas particularmente relevantes cuando pienso en ajustar mis condiciones son:

3a) ¿Qué otras corrientes pueden estar activas alrededor de los voltajes que me interesan? ¿Puedo bloquearlos con medicamentos específicos? ¿Puedo cambiar mi protocolo de voltaje para asegurarme de que estas corrientes contaminantes estén apagadas (o al menos no cambien)? En algunos casos, puedo usar el hecho de que diferentes canales tienen una dependencia de voltaje diferente para aislar una corriente . A menudo hay una compensación aquí entre obtener el protocolo de voltaje perfecto para su corriente y evitar las corrientes que no le interesan.

3b) ¿Cuál es el potencial de reversión de la corriente dadas mis condiciones? Por lo general, quiero visitar el potencial de inversión del canal, si es posible, pero generalmente no quiero establecer mi potencial de retención allí. Dadas mis composiciones de solución, ¿cuál es el potencial de equilibrio para cada ion que pasa a través de este canal? No me gusta utilizar el potencial de inversión esperado como potencial de retención, porque es más fácil de entender los resultados si se disocia el efecto de la fuerza motriz sobre los iones y el efecto de la interrupción del voltaje.

3c) ¿Mis condiciones afectan la dependencia del voltaje y / u otras propiedades de la corriente? AKA ¿Cómo puedo estar seguro de que mis respuestas a las preguntas anteriores son las correctas? En general, no puede depender de los hallazgos en otro sistema para que coincida exactamente con el comportamiento de las corrientes en * su * sistema. Entonces, cuando estoy empezando un nuevo experimento, creo mucho en el protocolo y espero alterar las cosas a medida que avanzo. Exploro y veo lo que pasa

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Algunos ejemplos concretos para ilustrar cómo todas estas consideraciones funcionan juntas. A menudo es cierto, como supones, que quieres comenzar desde un lugar donde hay poca o ninguna corriente. Por ejemplo, construir una curva de activación es mejor cuando comienzas desde un voltaje donde sabes que todos los canales están cerrados. Pero cuando construyes una curva de inactivación, quieres lo contrario y tienes todos los canales abiertos al principio para que puedas verlos cerca.

Luego hay casos intermedios, como las corrientes de KCNQ que menciona Karen, que, por cierto, definitivamente pasan corriente por debajo de -40 mV en algunas neuronas (ver el punto 3c). El protocolo canónico para probar la presencia de KCNQ es comenzar desde un potencial despolarizado como -20 o -30 mV para encender el canal y luego reducirlo a -60 mV y ver cómo se apaga la corriente. Tenga en cuenta que elegimos -20 mV en lugar de algo más despolarizado para evitar encender demasiados canales de potasio. Los voltajes exactos elegidos dependen del tipo de celda y las condiciones de grabación como mencioné anteriormente.

Un caso similar es aislar la corriente de potasio de tipo A inactivante usando una serie de pasos que comienzan desde -60 mV y otro que comienza desde -40 o -30 mV. Los pasos de -60 mV incluyen la corriente de tipo A pero también muchas otras corrientes de potasio. Como la corriente de tipo A está inactivada a -30 mV, los pasos de -30 mV no tienen corriente de tipo A, pero aún incluyen todas las demás corrientes que se activaron con los pasos de -60 mV. ¡La diferencia en el potencial de arranque aquí le permite ver una sola corriente por sí solo usando solo un truco de abrazadera de voltaje!