Esta es una pregunta frecuente en el mundo de la cultura celular y numerosos expertos han hecho todo lo posible para explicar qué tan cerca está lo suficientemente cerca. Se entiende bien que durante la expansión de la línea celular, pueden surgir mutaciones adicionales que pueden afectar el comportamiento de esa línea celular.
Afortunadamente, revise al Jefe Sarah Kennett de la División de Anticuerpos Monoclonales en la Oficina de Productos Biotecnológicos de la Oficina de Calidad Farmacéutica en el Centro de Evaluación e Investigación de Medicamentos de la Agencia de Medicamentos y Alimentos de los EE. UU. (Coloquialmente conocida como OBP / OPQ / CDER / FDA ¡Hurra por la burocracia!) Ha proporcionado varias recomendaciones sobre cómo las personas deben abordar estos problemas.
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El resumen del TLDR: Científicos y empresas resuelven este problema haciendo todo lo posible para garantizar que la célula sea estable clonalmente y luego pague mercenarios como Christopher VanLang Ph.D. Mucho dinero para hacer un montón de trabajo para demostrar que aún está estable años después.
Para empezar, los problemas de inestabilidad de la línea celular están bien documentados en la industria y la deriva genética es un riesgo entendido para la calidad del producto. Sin embargo, con los controles adecuados, puede asegurarse de que cualquier producto que produzcan las células sea consistente y, por lo tanto, puede demostrar que las conclusiones de los experimentos son compatibles con la ciencia y son independientes de la policlonalidad de la línea celular. Fuera de la biofarma, la estabilidad genética es un problema importante en la bioenergía ya que la deriva genética puede resultar en la dilución de células de alta producción y su reemplazo por células de crecimiento rápido. [1]
También se entiende que ciertas actividades tienen más probabilidades de afectar la estabilidad de la línea celular. Buenos ejemplos son las adaptaciones de los medios que cambian específicamente de medios basados en suero a medios libres de suero. [2]
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Las personas reconocen que la estabilidad genética puede afectar el proceso y es particularmente problemático que la mayoría de las líneas celulares se hayan derivado de células históricamente tumorigénicas para superar el límite de Hayflick. La línea celular CHO K1 fue derivada del ovario del hámster chino y cuando se compara la carología de las líneas celulares CHO utilizadas en la producción, no se encuentran los 22 cromosomas del hámster chino. Además, los cromosomas que se encuentran tienen importantes reordenamientos genéticos, variaciones estructurales e indeles. Es bastante aterrador pensar que toda la industria de la biotecnología se basa en líneas celulares que son inherentemente inestables.
Heterogeneidad genética de la línea celular CHO [3]
Por lo tanto, los grupos realizan grandes esfuerzos para garantizar que las líneas celulares se derivan de un origen de una sola célula genéticamente estable. Que es donde la FDA viene útil con sus consejos.
Para comenzar, las mejores prácticas han cambiado significativamente a lo largo de las décadas. Históricamente, los grupos de biología celular tienen células presionadas para amplificar su gen de interés asegurando un alto número de copias por selección genética. Sin embargo, lo que termina sucediendo es que obtendrá un alto grado de integración genética, pero una mayor posibilidad de integración en regiones inestables o cromosomas que conducen a una mayor inestabilidad genética. Ahora, con el advenimiento de herramientas de clonación e integración específicas del sitio como ZFN y CRISPR, los grupos pueden garantizar la integración estable de su gen de interés en las regiones altamente expresadas de los cromosomas más estables. Al reducir la presión de selección al reducir el alcance de la amplificación génica, obtienes una mayor probabilidad de tener una línea celular estable. Sin embargo, uno de los mayores desafíos de la transferencia de conocimiento académico a la industria es que la amplificación genética es muy fácil y preferida en la escuela de posgrado, mientras que es despreciada en la industria. Si se adquiere una línea celular de un laboratorio académico, es probable que haya que restablecer el banco.
Dado que las líneas celulares experimentan mucho estrés durante la adaptación de los medios y los ajustes al crecimiento en cultivos sin suero y en suspensión, generalmente se recomienda no comenzar la selección de células hasta después de que las células se hayan adaptado. Un desafío es que el desarrollo de los medios a menudo se bloquea después del desarrollo de la línea celular. Por lo tanto, generalmente se realiza un trabajo adicional para asegurar que las poblaciones celulares permanezcan consistentes.
Los grupos realizan grandes esfuerzos para obtener celdas individuales. Históricamente, esto se realiza limitando la dilución, es decir, 3 pocillos por célula. Sin embargo, la eficiencia de la galjanoplastia y el uso de Poisson Distributions para garantizar la monoclonalidad generalmente no es suficiente debido al potencial de que las células se peguen entre sí. Por lo general, se recomienda hacer varias rondas de dilución limitada. Sin embargo, la disponibilidad de la nueva tecnología de selección de células ha acelerado realmente la capacidad de la industria para hacer este trabajo de manera efectiva. Los métodos como FACS y captación de células con ayuda capilar han mejorado la capacidad de hacerlo rápidamente.
Parte de la demostración de monoclonalidad requiere una inspección visual de que existe una sola célula en el pozo. Sin embargo, se han identificado desafíos que incluyen: “la identificación de células individuales lleva mucho tiempo y puede incluso causar que los científicos se sientan mareados o con náuseas después de períodos prolongados en el microscopio”. [4] Debido a la falta de fiabilidad general de la precisión de los biólogos fatigados, los sistemas de imagen celular automatizados son ahora el estado de la técnica. Aún así, existen desafíos con estos sistemas de imaginación si, por ejemplo, las celdas están pegadas al borde de las paredes. Por lo tanto, se recomiendan imágenes de todo el pozo.
Suponiendo que la selección de la línea celular se realizó correctamente y ahora tiene una línea celular monoclonal estable, se realiza mucho trabajo posterior para garantizar que el proceso de fabricación no induzca la inestabilidad genética. Esto se discute ampliamente en el documento de la FDA Puntos a considerar en la producción y prueba de nuevas drogas y productos biológicos y producido por la tecnología de ADN recombinante: Caracterización de ácidos nucleicos y estabilidad genética. Debido a que estas líneas celulares probablemente tendrán integraciones múltiples, querrá tener métodos que puedan detectar con precisión el ADN y las variantes de ARNm. Debido a la probabilidad de que ciertas copias de ADN puedan estar inactivas, generalmente se prefiere que los métodos se realicen en los productos de transcripción a granel. Con el advenimiento de HTS de bajo costo, el grado en que esto se puede demostrar aumenta drásticamente. Al mismo tiempo, tener esa resolución de detalles también puede ser perturbador para propósitos regulatorios. También en la secuencia primaria de los genes, la integridad estructural de la línea celular también debe determinarse. De nuevo, esta es un área donde la secuenciación genómica se vuelve valiosa ya que usted recibe mayor poder para identificar variantes estructurales.
Una vez establecidos estos métodos, se debe implementar una estrategia de control adecuada para garantizar que los productos producidos por la célula sean consistentes, particularmente durante la expansión del inóculo. Como resultado, la consistencia de la creación del Working Cell Bank y el proceso experimental es valioso para demostrar la consistencia de la línea celular. Para aumentar la afirmación de que la línea celular se mantiene constante durante todo el experimento, las células adquiridas desde el final de la expansión, así como el Working Cell Bank, se pueden comparar con el Banco de células maestro. Como parte de este trabajo, se recomienda que se establezca un límite de edad celular in vitro en el que se muestra que las células mantienen la estabilidad hasta la edad celular demostrada.
Las autoridades de salud también han evolucionado posiciones sobre los métodos para demostrar la comparabilidad de múltiples experimentos. Tanto la FDA como el CHMP tienen proyectos sobre la demostración de comparabilidad y el estado del borrador es un factor importante en los retrasos de los biosimilares en los mercados. [5] [6] De hecho, los posibles cambios en el proceso de cultivo celular, el desarrollo de los medios, así como el establecimiento de nuevos bancos celulares y la introducción de nuevas instalaciones han exigido la demostración de la comparabilidad. Como tal, se pone mucho énfasis en demostrar que el material utilizado durante el IND es comparable con el material generado durante los ensayos clínicos, así como garantizar que se mantenga comparable a lo largo del ciclo biológico.
Sin embargo, uno de los desafíos para demostrar la estabilidad de la línea celular es que las empresas más grandes tienen el lujo de arrojar grandes cantidades de dinero y recursos para abordar estos problemas. Dado que una gran parte de los medicamentos son desarrollados inicialmente por académicos y biotecnología más pequeños, en la prisa por recopilar datos para reunir capital o para obtener un trato o una oferta pública inicial, muchos de los pasos que mencioné para controlar la estabilidad genética se apresuraron. Como resultado, la historia y el linaje del banco celular pueden tener poca documentación, ya que puede provenir de un cuaderno de un estudiante graduado al azar almacenado en su congelador -80. En última instancia, la línea celular podría volver a clonarse y se establecerá un nuevo banco de células maestras con el riesgo de perder comparabilidad con el perfil establecido en el IND.
Este problema también describe los grandes desafíos con los biosimilares. El enorme grado de heterogeneidad del proceso hace que sea extremadamente difícil para una empresa biosimilar realizar una ingeniería inversa de un proceso de fabricación y luego demostrar la biosimilitud ya que operará con una ventana mucho más ajustada que la compañía original.
En conclusión, la deriva genética y la inestabilidad son un problema real y se realiza mucho trabajo inicial para mitigar la posibilidad de que tenga una línea celular inestable. Una vez que se establece esa línea celular, la seguridad de que el proceso experimental es consistente y las comprobaciones posteriores de que la estabilidad de la línea celular se mantiene durante todo el proceso ayuda a respaldar la conclusión de que los resultados serán consistentes y reproducibles.
No soy un especialista en asuntos regulatorios y lo más importante, no soy su especialista en asuntos reglamentarios. Consulte a su equipo de regulación antes de actuar en mi respuesta.
Notas a pie de página
[1] Respuesta de Christopher VanLang a ¿Pueden las algas multicelulares contraer cáncer? Si es así, ¿podemos inducir cáncer en las algas para catalizar la producción de biocombustibles?
[2] http://www.fda.gov/downloads/Bio…
[3] Primer genoma de CHO.
[4] Cambio de paradigma para el desarrollo de líneas celulares | Artículos de la Revista GEN | GEN
[5] http://www.fda.gov/OHRMS/DOCKETS…
[6] http://www.triskel.com/1%20Guide…
