La inmunocitoquímica ( ICC ) y la inmunohistoquímica ( IHC ) son términos usados indistintamente para describir métodos que intentan identificar moléculas dentro de células y tejidos utilizando anticuerpos específicos que (podrían) unirlos usando manchas para visualizar dicha unión (1).
Los criterios de elección de anticuerpos en la tinción ICC / IHC son los mismos que con cualquier otro ensayo basado en anticuerpos, como ELISA, citometría de flujo, Western blot, lo que sea, es decir, asegurarse de que el rendimiento del anticuerpo (especificidad y reproducibilidad) se haya validado adecuadamente .
Los problemas críticos son falsos negativos y falsos positivos . Como su aplicación en técnicas biológicas ha explotado desde la década de 1980, lamentablemente los anticuerpos se han convertido en una fuente importante de problemas que alimentan la crisis de reproducibilidad científica (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8), simplemente porque muchos anticuerpos usados comúnmente no han sido debidamente validados El problema de la calidad de los anticuerpos es de proporciones descomunales, ya que se estima que hay> 180 empresas que producen y venden> 350000 anticuerpos con fines de investigación y clínicos (9).
Las encuestas sugieren que la validación de anticuerpos inadecuada, incluso inexistente, puede ser un problema epidémico crónico (ver más abajo de 10, énfasis mío, también leer 11).
Las respuestas de más de 500 científicos dentro de la comunidad de investigación de ciencias de la vida que respondieron a la encuesta mostraron que, aunque el 70% de los encuestados validaron o validaron anticuerpos comerciales, solo el 43% de los investigadores con menos de cinco años de experiencia informaron que validaron los anticuerpos adquiridos. solo el 22% informó la validación de anticuerpos producidos internamente. Aún más preocupante, la encuesta encontró que un tercio de estos futuros jefes de laboratorio no validan en absoluto .
Significativamente, menos de la mitad (44%) de los encuestados informaron recibir capacitación específica sobre validación y cómo validar los anticuerpos de investigación para aplicaciones específicas . Al evaluar las barreras para validar anticuerpos en su investigación, ha surgido una tendencia clara en años de experiencia: más del 25% de los investigadores con menos de cinco años de uso de anticuerpos indicaron que “no ven la necesidad” de realizar la validación de anticuerpos. Otras barreras percibidas incluyen que los laboratoristas sienten que ” toma demasiado tiempo ” (71%) y ” retrasa mi investigación ” (51%).
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La encuesta de anticuerpos de investigación identificó claramente la necesidad de mejorar las habilidades y el dominio de los científicos junior en la validación de anticuerpos específicos de la aplicación y para desarrollar estándares de validación que son ampliamente aceptados. La comunidad de investigación biomédica debe dedicar suficiente tiempo, recursos y experiencia para educar y capacitar a científicos en mejores prácticas para experimentos e informes basados en anticuerpos, así como validación específica de la aplicación.3 La encuesta de GBSI también indicó que las revistas deberían requerir que los autores identifiquen y describan todos los anticuerpos usados en un estudio como una condición explícita de publicación.4 La información esencial incluía el nombre del vendedor o individuo que suministró el anticuerpo, el inmunógeno usado para generar el anticuerpo, la naturaleza de la preparación del anticuerpo (p. ej., policlonal o monoclonal) , número de catálogo y lote y estado de validación, incluidos los datos de validación primaria si no se han publicado previamente.
Debido a que los números de catálogo de los proveedores no son estables a medida que los productos se descontinúan o venden, 5 GBSI también recomendó vincular cada anticuerpo a uno o más registros o bases de datos en línea y un portal dedicado de recursos biológicos como el eagle-i Network6 o el Portal de identificación de recursos.7 Además, las iniciativas recientes de NIH para mejorar el rigor y la reproducibilidad de la investigación financiada clarificaron y revisaron las instrucciones de solicitud de subvención y los criterios revisados al 25 de enero de 2016. Incluyeron expectativas, pero no requieren explícitamente que los recursos biológicos clave, como los anticuerpos, serán “regularmente autenticado para garantizar su identidad y validez para su uso en los estudios propuestos “.
Como se indica en el resumen de la encuesta GBSI, ” A pesar de su uso prolífico en el laboratorio, sin embargo, no existen pautas estandarizadas y ampliamente aceptadas sobre cómo validar los anticuerpos antes de su uso en la investigación preclínica, aunque se han propuesto algunos enfoques ” 3.
Dado que ICC / IHC son menos sensibles en comparación con otros ensayos basados en anticuerpos como ELISA, los falsos negativos y los falsos positivos pueden ser problemas mayores con ellos. La validación de anticuerpos es, por lo tanto, esencial para garantizar que los datos de tinción ICC / IHC sean específicos y reproducibles . La FDA (12) define la validación como
el proceso de demostrar, mediante el uso de investigaciones de laboratorio específicas, que las características de rendimiento de un método analítico son adecuadas para su uso analítico previsto
Obviamente, los proveedores de anticuerpos comerciales para ICC / IHC son una docena. Al mirar los catálogos de empresas,
- La Hoja de datos de anticuerpos suministrados es la información más importante .
- Los métodos utilizados para preparar el tejido así como para teñirlo para IHC / ICC son clave.
- Datos de validación de anticuerpos : la validación más estricta incluiría pruebas de especificidad y reproducibilidad en una amplia variedad de ensayos basados en anticuerpos, a saber. ELISA, Citometría de flujo, Inmunofluorescencia (IF), IHC / ICC, Immunoprecipitation (IP), Western Blot (WB).
- Las referencias suministradas por el proveedor que utilizaron un anticuerpo particular para ICC / IHC son recursos invaluables para el tipo de tejido / célula, preparación del tejido, especialmente el método de fijación (13, 14), el tipo de método de detección, etc. que funcionó. Es muy posible que el anticuerpo funcione como se anuncia cuando se usa exactamente de acuerdo con los parámetros publicados, pero no de otra manera.
- Siempre que utilicen anticuerpos en cualquier ensayo, los usuarios también deben documentar cuidadosamente el nombre del proveedor / proveedor, el catálogo y los números de lote (lote), nombres de clones de anticuerpos. Esta información es necesaria para la solución de problemas en el futuro cuando un ensayo que anteriormente funcionaba con fiabilidad comienza a convertirse en dispersión o deja de funcionar por completo.
- Antibodypedia, un sitio web que enumera los anticuerpos y detalles validados sobre el proceso de validación, es un recurso de uso obligatorio para cualquier científico que se preocupe por la procedencia de los anticuerpos que utilizan en su trabajo.
- Muchos anticuerpos se generan inmunizando animales de investigación no con la proteína purificada completa sino con péptidos sintéticos . Sin embargo, los péptidos sintéticos pueden no recapitular la estructura 3-D de la proteína nativa ni sus modificaciones postraduccionales (15).
- Incluso los anticuerpos monoclonales (mAbs) podrían resultar no específicos . Esto sucede porque los clones de células B de los que se derivan se cultivan en animales de investigación y anticuerpos que secretan recogidos y purificados de Ascites – Wikipedia. La cosa es que a menudo la ascitis contiene anticuerpos distintos al mAb de interés (16).
- Un estudio encontró que 7 de 20 mAbs (35%) tenían patrones de tinción que no coincidían con su supuesto antígeno diana y además cinco incluso no los mancharon (17).
- Los policlonales a menudo funcionan mejor que los mAb en IHC / ICC . Por ejemplo, el estándar industrial para las pruebas de HER2 en cáncer de mama es el anticuerpo Herceptest aprobado por la FDA de Dako (18). Dado que los anticuerpos policlonales consisten en un grupo de diferentes clones contra el antígeno diana, varios de los cuales pueden ser de alta afinidad, su superioridad sobre los mAbs para ICC / IHC puede deberse a una mayor probabilidad de que algunos o todos ellos se puedan unir bajo un rango de condiciones (16).
Dos enfoques generales para la validación de anticuerpos implican probar su unión en muestras que expresan o no expresan su antígeno diana.
- Control positivo : inserte el gen para el objetivo en cuestión en las líneas celulares mediante transfección transitoria, cultívelos, cosecha y centrifúguelos para luego realizar ICC con el anticuerpo en cuestión. El anticuerpo debe unirse específicamente en células transfectadas con la construcción en cuestión, pero no en las transfectadas con plásmido o plásmido vacío con alguna otra construcción.
- Control negativo : realizar ICC con el anticuerpo en cuestión en las células y / o tejidos donde el gen diana se ha eliminado (eliminado). No debe haber ni una mínima mancha. Hoy en día, con técnicas como el siRNA que se ha convertido en una corriente principal, es más fácil de hacer que nunca, así que no hay excusas para no usarlas para validar objetivos de anticuerpos.
Por supuesto, el estándar de oro es validar el anticuerpo en la empresa . Actualmente, la recomendación de consenso es un conjunto de cinco mejores prácticas que los autores llaman los cinco pilares para la validación de anticuerpos (véase más abajo de 19).
El laboratorio de David Rimm en la Universidad de Yale ha publicado un enfoque detallado de validación de anticuerpos específicamente aplicable para IHC / ICC (ver debajo de 16).
Bibliografía
1. Haines, Deborah M. y Keith H. West. “Inmunohistoquímica: forjar los vínculos entre la inmunología y la patología”. Inmunología e inmunopatología veterinaria 108.1 (2005): 151-156.
2. Rhodes, Kenneth J. y James S. Trimmer. “Los anticuerpos son valiosas herramientas de investigación neurocientífica frente a reactivos de distracción masiva”. Journal of Neuroscience 26.31 (2006): 8017-8020. https: //pdfs.semanticscholar.org…
3. Pradidarcheep, Wisuit, y col. “Falta de especificidad de los antisueros comercialmente disponibles: se necesitan mejores especificaciones”. Journal of Histochemistry & Cytochemistry 56.12 (2008): 1099-1111. http://journals.sagepub.com/doi/…
4. Couchman, John R. “Anticuerpos comerciales: los buenos, malos y realmente feos”. Journal of Histochemistry & Cytochemistry 57.1 (2009): 7-8. http://journals.sagepub.com/doi/…
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6. Parseghian, Missag Hagop. “Antígenos autostopistas: resultados inconsistentes de ChIP, datos de inmunohistología cuestionables y un rendimiento deficiente de los anticuerpos pueden tener un factor común”. Biochemistry and Cell Biology 91.6 (2013): 378-394. http://www.nrcresearchpress.com/…
7. Schonbrunn, Agnes. “El anticuerpo puede hacerlo bien: enfrentando problemas de especificidad e irreproductibilidad de anticuerpos”. (2014): 1403-1407. https://www.researchgate.net/pro…
8. Baker, Monya. “Culpe a los anticuerpos”. Nature 521.7552 (2015): 274. http://www.abgent.com.cn/assets/…
9. Página de recursos de anticuerpos | Proveedores de Anticuerpo (AH)
10. Freedman, Leonard P. “El caso para la validación de anticuerpos en entornos clínicos”. Vacuna (2017): 0. El caso para la validación de anticuerpos en entornos clínicos
11. Freedman, Leonard P., y col. “La necesidad de una mejor educación y capacitación en el uso de anticuerpos de investigación y prácticas de validación”. BioTechniques 61.1 (2016): 16-18. http://www.biotechniques.com/mul…
12. https://www.fda.gov/downloads/Dr….
13. Willingham, Mark C. “Epítopes condicionales: ¿tu anticuerpo siempre es específico?” Journal of Histochemistry & Cytochemistry 47.10 (1999): 1233-1235. http://journals.sagepub.com/doi/…
14. Saper, Clifford B., y Paul E. Sawchenko. “Péptidos mágicos, anticuerpos mágicos: directrices para controles apropiados para inmunohistoquímica”. Journal of Comparative Neurology 465.2 (2003): 161-163.
15. Jensen, Brian C., Philip M. Swigart, y Paul C. Simpson. “Diez anticuerpos comerciales para subtipos de receptores alfa-1-adrenérgicos son inespecíficos”. Archivos de farmacología de Naunyn-Schmiedeberg 379.4 (2009): 409. https://www.researchgate.net/pro…
16. Bordeaux, Jennifer, et al. “Validación de anticuerpos”. Biotechniques 48.3 (2010): 197. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc…
17. Spicer, Samuel S., et al. “Algunas preparaciones de anticuerpos monoclonales de ascitis contienen contaminantes que se unen a zonas de Golgi seleccionadas o células cebadas”. Journal of Histochemistry & Cytochemistry 42.2 (1994): 213 – 221. http://journals.sagepub.com/doi/…
18. Jacobs, Timothy W., et al. “Especificidad de HercepTest para determinar el estado HER-2 / neu de los cánceres de mama utilizando el sistema de puntuación aprobado por la Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos”. Journal of Clinical Oncology 17.7 (1999): 1983-1983. http://ascopubs.org/doi/pdfdirec…
19. Uhlen, Mathias, et al. “Una propuesta para la validación de anticuerpos”. Métodos de la naturaleza (2016). http://www.novopro.cn/ueditor/ph…
Gracias por el R2A, Anthony Mok.
