La base del ensayo de placa es medir la capacidad de un solo virus infeccioso para formar una “placa” en células de cultivo monocapa concurrentes. Una placa se desarrolla como parte de la infección de una célula por una sola partícula de virus que es seguida por la replicación de ese virus, y finalmente, la muerte de la célula. Las partículas de virus recién replicadas infectarán y luego matarán las células circundantes.
Para esta técnica, se nos proporcionará un stock de fagos virulento y un cultivo de células huésped susceptible. Se preparan diluciones de 10 veces del stock de fagos. El procedimiento requiere el uso de una técnica de Agar de doble capa (DLA) también conocida como método de doble capa de agar, en la que el agar duro sirve como capa base (para formar gel) y una mezcla de pocas partículas de fago (material diluido) y una gran cantidad de células hospedadoras en un agar blando forma la capa superior. Cuando las placas se incuban, las células susceptibles de Escheria coli se multiplican rápidamente y producen un césped de crecimiento confluente en el medio. Cuando una partícula de fago se adsorbe en una célula susceptible, penetra en la célula, se replica y libera nuevas partículas de fago que infectan a otras bacterias en las proximidades de la célula anfitriona inicial. El crecimiento o propagación de los nuevos virus está restringido o limitado a las células vecinas por el gel. Este ciclo se repite hasta que se hayan destruido grandes cantidades de bacterias. Las células destruidas producen áreas circulares no turbias, llamadas placas en el césped bacteriano, donde no hay crecimiento de bacterias porque la progenie del fago que se origina a partir de partículas de virus individuales se ha multiplicado lo suficiente como para matar bacterias sobre un área fácilmente visible. Finalmente, la placa se vuelve demasiado grande para ser visible a simple vista. Cada placa representa la lisis de un cultivo bacteriano infectado con fagos y puede designarse como una unidad formadora de placa (PFU) y se usa para cuantificar el número de partículas de fagos infectivos en el cultivo. Los tintes que tiñen las células vivas se utilizan con frecuencia para mejorar el contraste entre las placas y las células vivas. Por lo tanto, las células muertas en la placa aparecerán sin teñir contra el fondo de color. Solo los virus que tienen la capacidad de causar daño visible a las células se pueden analizar de esta manera.
El número de partículas de fago contenidas en el cultivo de fagos de reserva original se determina contando el número de placas formadas en la placa de agar con semillas y multiplicándolo por el factor de dilución. Para un recuento de fagos válido, el número de placas por placa no debe exceder 300 ni ser inferior a 30. Las placas que muestran más de 300 UFP son demasiado numerosas para contar (TNTC); las placas que muestran menos de 30 PFU son demasiado pocas para contar (TFTC).
